一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標記的金標免疫層析試紙條的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標記的金標免疫層析試紙條的制備方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，傳統(tǒng)的膠體金標記技術(shù)的研宄最早始于上世紀60年代初，膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，能夠與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。因為膠體金顏色比較明顯，肉眼即可辨別，因此無需任何儀器。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還能夠與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA。
[0003]膠體金免疫層析法試紙條的研制原理是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維素膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，在吸水材料的牽引下，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后，樣本中的被測抗原或抗體首先與金標抗體結(jié)合成抗原抗體復合物，抗原抗體復合物上行到檢測線時，被測抗原的另一結(jié)合位點與包被在此處的單抗結(jié)合，形成兩個抗體結(jié)合一個抗原(雙抗體夾心)的金標復合物，因有金顆粒在此沉積，故檢測線顯紅色。未結(jié)合抗原的金標抗體上行到對照線時，與〃抗金標抗體〃結(jié)合，所以對照線也顯紅色。如果待測標本中無被測抗原即陰性樣本，試紙條上只有金標抗體上行并與對照線處的抗體結(jié)合，因而檢測線不顯線，對照線顯紅色。
[0004]現(xiàn)在傳統(tǒng)的廣泛應(yīng)用的金標免疫層析法試紙條多為用單一膠體金標記，典型的層析法檢測試劑的組成成份分為三個部分，其一是多孔材料，包括樣品墊、吸水墊、結(jié)合墊及硝酸纖維膜；其二是試劑，如抗體、金標結(jié)合物；其三是層壓結(jié)構(gòu)及卡塞，如PVC板、雙面膠、卡塞。
[0005]基于膠體金標記技術(shù)的免疫層析法體外診斷試劑目前已經(jīng)有了很廣泛大應(yīng)用，但是僅以膠體金作為標記物和顯色劑需要較高濃度的標記物，耗費抗體或抗原的量較多，而且需要較大直徑的金顆粒，例如40nm的粒徑，才能獲得較高的靈敏度，檢測低濃度樣本時，容易發(fā)生假陰性，而當金顆粒過大時，標記物又不穩(wěn)定，長期貯存容易發(fā)生自動聚集。這些缺點導致膠體金標記的免疫層析試紙多集中在定性檢測領(lǐng)域，在定量、半定量檢測領(lǐng)域沒有得到廣泛應(yīng)用。
[0006]乳膠標記蛋白一般都是使用羧基和氨基的偶聯(lián)方法進行偶聯(lián)的，乳膠表面有羧基，經(jīng)過活化后和蛋白的氨基結(jié)合形成共價鍵，乳膠標記主要用于膠乳增強免疫比濁法檢測，主要是將通常是50nm?500nm粒徑的高分子顆粒的乳膠顆粒偶聯(lián)上抗體，通過抗體的反應(yīng)，相互交聯(lián)，通過生化儀的投射或散射光進行掃描，比較反應(yīng)前后的光路變化，檢測抗原的量。主要適用于全自動生化儀，檢測結(jié)果快速，單個樣本檢測只需要1min左右，能夠大通量檢測，靈敏度比較高，能夠定量檢測。但是因為檢測過程中需要全自動生化儀這種大型儀器，因此不利于在診所或床旁檢驗推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠克服上述技術(shù)問題的膠體金和乳膠微球聯(lián)合標記的金標免疫層析試紙條的制備方法；本發(fā)明的一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標記的金標免疫層析試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0008](I)利用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金溶液，制備的膠體金粒徑在30nm?40nm范圍內(nèi)；
[0009](2)用膠體金溶液標記蛋白分子，因為蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點或偏堿的條件下，膠體金溶液和蛋白分子這二者容易形成牢固的結(jié)合物，如果膠體金的PH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，則會聚集而失去結(jié)合能力，除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質(zhì)的分子量都影響膠體金溶液與蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此標記前應(yīng)調(diào)節(jié)膠體金的pH值，并選擇合適的離子濃度條件標記蛋白分子，標記之前應(yīng)對待標記的蛋白溶液進行透析，以除去聚合物，膠體金標記蛋白以后應(yīng)通過離心重懸的方式進行純化，得到標記膠體金溶液；
[0010](3)直接購買或制備50nm的紅色乳膠微球；
[0011](4)用乳膠微球標記蛋白分子，標記時先將待標記蛋白在pH值為6的2-(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液中進行透析；透析后對待標記蛋白進行合適的處理，主要是除去緩沖液中游離的氨基；用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)緩沖體系活化乳膠微球上的羧基，調(diào)整乳膠和待標記蛋白溶液的pH值后，將兩者混合，用磁力攪拌器攪拌2?8小時，利用抗體蛋白分子表面的氨基與乳膠微球上的羧基發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)完成偶聯(lián)，然后將標記物離心，離心分離后棄掉上清液，留取沉淀物，此時的沉淀物即為乳膠-蛋白分子標記物，用緩沖液將該沉淀物調(diào)至所需濃度得到含表面活性劑及防腐劑的乳膠標記溶液；
[0012](5)對于上述步驟中得到的標記膠體金溶液和乳膠標記溶液進行質(zhì)量鑒定，質(zhì)量鑒定合格后將標記膠體金溶液和乳膠標記溶液按照體積比1:1的方式混合，將該混合液用劃膜噴金機噴涂于結(jié)合墊上烘干，所述烘干溫度為37±1°C ;
[0013](6)將硝酸纖維素膜貼于PVC塑料底板上，將對照線和檢測線要包被的蛋白分子分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上烘干，所述烘干溫度為37±1°C ;
[0014](7)將樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、手柄紙、Max膠組裝于PVC塑料墊板上，切條、密封加干燥劑保存，如果是卡型或筆型試紙，還需要將試紙條扣到卡塞中再進行包裝；所述樣品墊為玻璃纖維紙；
[0015](8)將制備好的金標試紙條按照產(chǎn)品的質(zhì)量標準進行質(zhì)檢。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點是提高了金標免疫層析試紙條的檢測靈敏度和檢測范圍，從而擴大了膠體金免疫診斷的應(yīng)用領(lǐng)域和定量應(yīng)用，本發(fā)明選擇的膠體金顆粒是粒徑約為30nm?40nm的紅色膠體金，乳膠是選擇的粒徑約為50nm的紅色乳膠微球，該乳膠微球分散性好，粒徑分布窄，色彩鮮艷，成本低廉，膠體金和乳膠混合標記后，硝酸纖維素膜上C、T線的顏色變得更為鮮艷，產(chǎn)品靈敏度提高，梯度更加明顯，應(yīng)用本發(fā)明制備的檢測試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)對被測物質(zhì)的定性、半定量或定量檢測，以C-反應(yīng)蛋白膠體金法免疫層析檢測試紙條為例，目前市場上已有多種C-反應(yīng)蛋白定性或半定量的膠體金免疫層析法檢測試紙，但是檢測的CRP(C-反應(yīng)蛋白，C-Reactive Protein)靈敏度多低于5mg/l，應(yīng)用本發(fā)明的膠體碳和乳膠微球聯(lián)合標記的技術(shù)后，能將金標免疫層析法檢測試紙的靈敏度提高到0.5mg/l以上；因此，本發(fā)明具有較強的實用價值