和現(xiàn)實(shí)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明的一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標(biāo)記的金標(biāo)免疫層析試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0018](I)利用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金溶液，制備的膠體金粒徑在30nm?40nm范圍內(nèi)；
[0019](2)用膠體金溶液標(biāo)記蛋白分子，因?yàn)榈鞍椎奈街饕Q于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，膠體金溶液和蛋白分子這二者容易形成牢固的結(jié)合物，如果膠體金的PH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力，除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量都影響膠體金溶液與蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此標(biāo)記前應(yīng)調(diào)節(jié)膠體金的pH值，并選擇合適的離子濃度條件標(biāo)記蛋白分子，標(biāo)記之前應(yīng)對(duì)待標(biāo)記的蛋白溶液進(jìn)行透析，以除去聚合物，膠體金標(biāo)記蛋白以后應(yīng)通過離心重懸的方式進(jìn)行純化，得到標(biāo)記膠體金溶液；
[0020](3)直接購(gòu)買或制備50nm的紅色乳膠微球；
[0021](4)用乳膠微球標(biāo)記蛋白分子，標(biāo)記時(shí)先將待標(biāo)記蛋白在pH值為6的2-(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液中進(jìn)行透析；透析后對(duì)待標(biāo)記蛋白進(jìn)行合適的處理，主要是除去緩沖液中游離的氨基；用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)緩沖體系活化乳膠微球上的羧基，調(diào)整乳膠和待標(biāo)記蛋白溶液的pH值后，將兩者混合，用磁力攪拌器攪拌2?8小時(shí)，利用抗體蛋白分子表面的氨基與乳膠微球上的羧基發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)完成偶聯(lián)，然后將標(biāo)記物離心，離心分離后棄掉上清液，留取沉淀物，此時(shí)的沉淀物即為乳膠-蛋白分子標(biāo)記物，用緩沖液將該沉淀物調(diào)至所需濃度得到含表面活性劑及防腐劑的乳膠標(biāo)記溶液；
[0022](5)對(duì)于上述步驟中得到的標(biāo)記膠體金溶液和乳膠標(biāo)記溶液進(jìn)行質(zhì)量鑒定，質(zhì)量鑒定合格后將標(biāo)記膠體金溶液和乳膠標(biāo)記溶液按照體積比1:1的方式混合，將該混合液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊上烘干，所述烘干溫度為37±1°C ;
[0023](6)將硝酸纖維素膜貼于PVC塑料底板上，將對(duì)照線和檢測(cè)線要包被的蛋白分子分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上烘干，所述烘干溫度為37±1°C ;
[0024](7)將樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、手柄紙、Max膠組裝于PVC塑料墊板上，切條、密封加干燥劑保存，如果是卡型或筆型試紙，還需要將試紙條扣到卡塞中再進(jìn)行包裝；所述樣品墊為玻璃纖維紙；
[0025](8)將制備好的金標(biāo)試紙條按照產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)檢。
[0026]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)，能夠輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標(biāo)記的金標(biāo)免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)利用梓檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金溶液，制備的膠體金粒徑在30nm?40nm范圍內(nèi)； (2)用膠體金溶液標(biāo)記蛋白分子，因?yàn)榈鞍椎奈街饕Q于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，膠體金溶液和蛋白分子這二者容易形成牢固的結(jié)合物，如果膠體金的PH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力，除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量都影響膠體金溶液與蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此標(biāo)記前應(yīng)調(diào)節(jié)膠體金的PH值，并選擇合適的離子濃度條件標(biāo)記蛋白分子，標(biāo)記之前應(yīng)對(duì)待標(biāo)記的蛋白溶液進(jìn)行透析，以除去聚合物，膠體金標(biāo)記蛋白以后應(yīng)通過離心重懸的方式進(jìn)行純化，得到標(biāo)記膠體金溶液； (3)直接購(gòu)買或制備50nm的紅色乳膠微球； (4)用乳膠微球標(biāo)記蛋白分子，標(biāo)記時(shí)先將待標(biāo)記蛋白在pH值為6的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液中進(jìn)行透析；透析后對(duì)待標(biāo)記蛋白進(jìn)行合適的處理，主要是除去緩沖液中游離的氨基；用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)緩沖體系活化乳膠微球上的羧基，調(diào)整乳膠和待標(biāo)記蛋白溶液的pH值后，將兩者混合，用磁力攪拌器攪拌2?8小時(shí)，利用抗體蛋白分子表面的氨基與乳膠微球上的羧基發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)完成偶聯(lián)，然后將標(biāo)記物離心，離心分離后棄掉上清液，留取沉淀物，此時(shí)的沉淀物即為乳膠-蛋白分子標(biāo)記物，用緩沖液將該沉淀物調(diào)至所需濃度得到含表面活性劑及防腐劑的乳膠標(biāo)記溶液； (5)對(duì)于上述步驟中得到的標(biāo)記膠體金溶液和乳膠標(biāo)記溶液進(jìn)行質(zhì)量鑒定，質(zhì)量鑒定合格后將標(biāo)記膠體金溶液和乳膠標(biāo)記溶液按照體積比1:1的方式混合，將該混合液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊上烘干； (6)將硝酸纖維素膜貼于PVC塑料底板上，將對(duì)照線和檢測(cè)線要包被的蛋白分子分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上烘干； (7)將樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、手柄紙、Max膠組裝于PVC塑料墊板上，切條、密封加干燥劑保存，如果是卡型或筆型試紙，還需要將試紙條扣到卡塞中再進(jìn)行包裝； (8)將制備好的金標(biāo)試紙條按照產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)檢。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標(biāo)記的金標(biāo)免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中的烘干溫度為37 ± I °C。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標(biāo)記的金標(biāo)免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟￠)中的烘干溫度為37 ± I °C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標(biāo)記的金標(biāo)免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中的樣品墊為玻璃纖維紙。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種膠體金和乳膠微球聯(lián)合標(biāo)記的金標(biāo)免疫層析試紙條的制備方法,包括以下步驟：(1)利用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金溶液；(2)用膠體金溶液標(biāo)記蛋白分子；(3)直接購(gòu)買或制備50nm的紅色乳膠微球；(4)用乳膠微球標(biāo)記蛋白分子；(5)對(duì)于上述步驟中得到的標(biāo)記膠體金溶液和乳膠標(biāo)記溶液進(jìn)行質(zhì)量鑒定；(6)將硝酸纖維素膜貼于PVC塑料底板上；(7)將樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、手柄紙、Max膠組裝于PVC塑料墊板上；(8)將制備好的金標(biāo)試紙條按照產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)檢。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提高了金標(biāo)免疫層析試紙條的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)范圍，從而擴(kuò)大了膠體金免疫診斷的應(yīng)用領(lǐng)域和定量應(yīng)用。
【IPC分類】G01N33/531, G01N33/68, G01N33/58, G01N33/558
【公開號(hào)】CN104991058
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510390430
【發(fā)明人】宋曉峰
【申請(qǐng)人】宋曉峰, 余強(qiáng)華
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月6日