單細(xì)胞的機(jī)械表型化：高通量定量檢測和分選的制作方法
【專利說明】單細(xì)胞的機(jī)械表型化：高通量定量檢測和分選
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請涉及2013年3月13日提交的USSN13/802, 684的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，USSN 13/802, 684要求2012年11月5日提交的USSN61/722, 689的優(yōu)先權(quán)，兩者都為所有目的通 過引用整體并入本文。
[0003] 政府支持的聲明
[0004][不適用]
[0005] 背景
[0006] 細(xì)胞是軟的、粘彈性的材料，其主要結(jié)構(gòu)組成部分是蛋白和膜，并且其機(jī)械表型可 以在病理轉(zhuǎn)化期間顯著改變。例如，在瘤形成進(jìn)展期間，細(xì)胞骨骼重組導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)械模量 (更常稱為硬度）的可測量的增加（Suresh(2007)ActaBiomaterialia, 3:413-438;Cross 等人（2007)Nat.Nanotechnol.，2 :780-783)。藥物治療還可以導(dǎo)致改變的細(xì)胞機(jī)械表型： 用某些化療藥物治療的人類白血病細(xì)胞表現(xiàn)出增加的模量（Lam等人（2007)Bl〇〇d，109: 3505-3508)。我們實(shí)驗(yàn)室的初步結(jié)果也顯示，我們可以檢測卵巢癌細(xì)胞在用將癌表型轉(zhuǎn)向 健康表型的微RNA治療之后的機(jī)械轉(zhuǎn)化，如通過常規(guī)增殖和細(xì)胞凋亡測定所評價(jià)的；以統(tǒng) 計(jì)學(xué)顯著的邊際，經(jīng)治療的細(xì)胞比基礎(chǔ)卵巢癌細(xì)胞較不可變形。因此，用于評價(jià)癌癥治療的 有希望的新遠(yuǎn)景是開發(fā)細(xì)胞的機(jī)械簽名。
[0007] 而認(rèn)為完全開發(fā)細(xì)胞的機(jī)械特征（例如，針對癌癥或其他應(yīng)用）是定量測量大量 細(xì)胞（例如每天之內(nèi)>1〇 2,或>1〇3,或>1〇4,或>1〇5個(gè)細(xì)胞）以便統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著分析細(xì)胞亞 群所需要的。據(jù)信，這一般需要以之前方法不能提供的通量來處理大量細(xì)胞。目前用于機(jī) 械表型化的方法，例如原子力顯微術(shù)（AFM)，提供了全部細(xì)胞群的小子集的詳細(xì)且準(zhǔn)確的細(xì) 胞模量測量。然而，由于緩慢的檢測速度，使用提供定量數(shù)據(jù)的目前系統(tǒng)，樣品大小通常限 于小于100個(gè)細(xì)胞/天（參見例如，圖1)。相反，用于細(xì)胞表征的常見且有效的技術(shù)，熒光 激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)，以每秒大約104個(gè)細(xì)胞的檢測速率操作，并且提供了通過熒光標(biāo)志 物評估的特定蛋白水平的群體統(tǒng)計(jì)。
[0008] 概述
[0009] 本文提供了允許基于各種機(jī)械（或其他）參數(shù)（例如，彈性模量、剪切硬度、粘度、 變形后松弛、各種電性質(zhì)等）而快速定量篩選大量細(xì)胞的裝置和方法。在某些實(shí)施方案中， 儀器和方法有利于促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或恢復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型的化合物的鑒別。在某些實(shí)施方 案中，提供了鑒別靶向細(xì)胞亞群的治療的儀器和方法，所述細(xì)胞亞群包括惡化前的、藥物抗 性的或者可能引起癌癥復(fù)發(fā)的那些。
[0010] 在某些實(shí)施方案中，提供了用于機(jī)械表征細(xì)胞或微粒、微生物、或細(xì)胞器的裝置， 其中所述裝置包括微流體通道，包括：在所述通道第一側(cè)的振蕩元件；和與所述振蕩元件 相對的在所述通道第二側(cè)的檢測元件，其中所述檢測元件被配置成檢測由所述振蕩元件通 過細(xì)胞或微粒傳送的力。在某些實(shí)施方案中，提供了用于機(jī)械表征細(xì)胞或微粒的裝置，其中 所述裝置包括微流體通道，所述微流體通道包括：在所述通道的一個(gè)第一側(cè)的集成振蕩器 和傳感器元件，其中所述傳感器被配置成檢測由所述振蕩器通過細(xì)胞或微粒傳送的力。在 某些實(shí)施方案中，振蕩元件以范圍從約5Hz、或從約20Hz、或從約15Hz、或從約20Hz、或從約 30Hz、或從約40Hz、或從約50Hz、或從約60Hz或從約80Hz、或從約100Hz、或從約200Hz、或 從約300Hz、或從約400Hz、或從約500Hz至約4kHz或至約3kHz、或至約2kHz、或至約1kHz 的頻率振蕩。在某些實(shí)施方案中，振蕩元件以范圍從約5Hz、或從約20Hz、或從約15Hz、或從 約20Hz、或從約30Hz、或從約40Hz、或從約50Hz、或從約60Hz或從約80Hz至約100Hz、或 至約150Hz、或至約200Hz、或至約250Hz、或至約300Hz、或至約350Hz、或至約400Hz、或至 約450Hz、或至約500Hz的頻率振蕩。在某些實(shí)施方案中，振蕩元件以范圍從約200Hz至約 600Hz的頻率振蕩。在某些實(shí)施方案中，振蕩元件以約400Hz的頻率振蕩。在某些實(shí)施方案 中，通道的寬度足以通過單細(xì)胞（例如，一次一個(gè)單細(xì)胞）。在某些實(shí)施方案中，通道的寬 度足以通過微米級水凝膠或小生物體（例如，秀麗隱桿線蟲（C.elegans)、細(xì)菌等）。在某 些實(shí)施方案中，通道的寬度范圍從約1ym、或從約5ym、或從約10ym至約300ym、或至約 200ym、或至約100ym、或至約90ym、或至約80ym、或至約70ym、或至約60ym、或至約 50ym.。在某些實(shí)施方案中，通道的寬度范圍從約5yM至約100ym。在某些實(shí)施方案中， 通道的寬度范圍從約5yM至約70ym。在某些實(shí)施方案中，振蕩元件包括梳驅(qū)動。在某些 實(shí)施方案中，檢測元件包括梳。在某些實(shí)施方案中，振蕩元件被配置成響應(yīng)于變化的電勢而 振蕩。在某些實(shí)施方案中，檢測元件被配置成通過檢測梳電容變化來檢測梳指的位移。在 某些實(shí)施方案中，包括所述振蕩元件的梳和/或包括所述檢測元件的梳還包括使梳指返回 中性位置的橫梁彈簧。在某些實(shí)施方案中，所述裝置包括運(yùn)載去離子水和/或蒸餾水跨越 所述梳和/或相關(guān)電子儀器的第二通道或流體管線。在某些實(shí)施方案中，所述裝置包括運(yùn) 載具有比第一通道中的流體更低介電常數(shù)的流體（例如，油）的第二通道或流體管線。在 某些實(shí)施方案中，所述裝置包括在其中形成、嵌入或模制所述通道的制造塊體。在某些實(shí)施 方案中，從其制造所述裝置的塊體材料選自由以下組成的組：聚二甲基硅氧烷（PDMS)、聚 烯烴塑性體（POP)、全氟聚乙烯（PFPE)、聚氨酯、聚酰亞胺、和交聯(lián)的NOVQLAC⑩（酚醛 聚合物）樹脂、硼硅玻璃、SF11玻璃、SF12玻璃、聚苯乙烯、Pyrex7740、PMMA和聚碳酸酯。 在某些實(shí)施方案中，所述裝置或包含所述裝置的系統(tǒng)包括移動細(xì)胞和/或試劑穿過或進(jìn)入 所述微通道和/或所述微腔的栗或壓力系統(tǒng)。
[0011] 在某些實(shí)施方案中，提供了機(jī)械表征細(xì)胞、顆粒、微生物或細(xì)胞器的方法，其中所 述方法包括：使所述細(xì)胞、顆粒、微生物或細(xì)胞器穿過本文描述和/或本文要求保護(hù)的裝置 的微流體通道；操作所述振蕩元件以應(yīng)用力至所述細(xì)胞、顆粒、微生物或細(xì)胞器；和檢測所 述檢測元件中的電容變化，以提供細(xì)胞、顆粒、微生物或細(xì)胞器對所述力的響應(yīng)的量度，其 中所述響應(yīng)提供所述細(xì)胞、顆粒、微生物或細(xì)胞器的機(jī)械性質(zhì)的量度。在某些實(shí)施方案中， 所述裝置以約400Hz的基本頻率和約0. 5MHz的運(yùn)載頻率操作。
[0012] 在某些實(shí)施方案中，可以通過高速成像監(jiān)測細(xì)胞（或顆粒）對力的響應(yīng)，以檢測細(xì) 胞（或顆粒）的輪廓和松弛行為。
[0013]
[0014] 術(shù)語梳驅(qū)動指致動器（例如，電容致動器），常用作線性致動器，其利用在兩個(gè)電 傳導(dǎo)梳之間作用的靜電力。梳驅(qū)動致動器通常以微米或納米級操作，并且一般通過本體微 機(jī)械加工或表面微機(jī)械加工硅片基底來生產(chǎn)。當(dāng)在靜態(tài)的梳和移動的梳之間應(yīng)用電壓時(shí)產(chǎn) 生吸引的靜電力，使得它們吸引在一起。在縱向設(shè)計(jì)中（例如，如本文所述的0°取向），電 容隨梳位移而線性變化，但力是電壓的函數(shù)。在橫向設(shè)計(jì)中（例如，如本文所述的90°取 向），力具有與位移的立方關(guān)系，以及在電容和位移之間的反比關(guān)系?；旌显O(shè)計(jì)，如本文描述 的20°混合設(shè)計(jì)，具有更復(fù)雜的關(guān)系。通常安排梳使得它們從不接觸（因?yàn)闀]有電壓差 異）。通常，安排齒使得它們可以相互滑過，直至每個(gè)齒占據(jù)相對梳中的狹縫。在某些實(shí)施 方案中，可以添加恢復(fù)彈簧、杜桿和曲柄軸以提供恢復(fù)力，和/或如果梳驅(qū)動的線性操作轉(zhuǎn) 換為旋轉(zhuǎn)或其他運(yùn)動。
[0015] 附圖簡述
[0016] 圖1示例說明本文描述的系統(tǒng)與其他機(jī)械測量系統(tǒng)相比較的檢測頻率和模量檢 測范圍。如本圖所示例說明的，本文描述的MaPS系統(tǒng)明顯提高了檢測頻率，并因此能夠 有效篩選大的藥物文庫并實(shí)現(xiàn)基于機(jī)械表型的細(xì)胞分選。關(guān)鍵詞：原子力顯微術(shù)（AFM) (Cross等人（2007)Nat.Nanotechnol.，2 :780_783)、全細(xì)胞拉伸（WCS)(Thoumine等 人，（1999)J.Biochem.Biophys.Meth.，39 :47-62)、微量移液器抽吸（MA)(Liu等人（2007) InIEEEInternationalConferenceonRoboticsandAutomation,Roma,Italy,第 1930-1935 頁）、微流變（MR)(Lam等人（2007)Blood, 109 :3505-3508;Tseng等人（2002) Biophys.J. 83:3162-3176)、光學(xué)鑷子（0T)(Sraj等人（2010)J.Biomed.Optics, 15: 047010;Guck等人（2000)Phys.Rev.Letts. 84 :5451-5454)和磁力扭轉(zhuǎn)細(xì)胞計(jì)量術(shù)（MTC) Fabry等人（1999)J.MagnetismMagneticMat. 194:120-125。細(xì)胞變形器和FACS不測量 細(xì)胞模量，但是在場外顯示供對比。
[0017] 圖2A-2C示例說明使用細(xì)胞變形器微流體測定來區(qū)分過表達(dá)核支架蛋白、核纖層 蛋白A與模擬對照的HL60細(xì)胞的初步研究的結(jié)果。
[0018] 圖3示例說明可以如何使用MaPS來高效篩選藥物文庫。用藥物治療的細(xì)胞預(yù)期 表現(xiàn)出增加的模量，例如在Lam等人（2007)Blood, 109 :3505-3508中所示。
[0019] 圖4示例說明在微流體通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)集成了MEMS振蕩器和傳感器的MaPS裝置。
[0020] 圖5示例說明了在MAPs裝置中微流體通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)MEMS振蕩器和傳感器的集成。 [0021 ] 圖6示例說明了在較大MaPS系統(tǒng)內(nèi)的有源MEMS裝置結(jié)構(gòu)。振蕩驅(qū)動在穿過探針 接口時(shí)探測細(xì)胞。力傳遞至傳感器探針，作為細(xì)胞模量的函數(shù)。圖7給出更多細(xì)節(jié)。
[0022] 圖7示例說明圖5和圖6的復(fù)合，具有更多細(xì)節(jié)。
[0023] 圖8,圖版A-E示例說明根據(jù)本文描述的裝置的某些方面的MaPS系統(tǒng)。如圖版A 中示例說明的，微流體網(wǎng)絡(luò)具有三個(gè)平行通道。兩個(gè)去離子水通道隔離電子組件，并且細(xì)胞 介質(zhì)通道遞送細(xì)胞至MEMS裝置。細(xì)胞介質(zhì)通道具有分離細(xì)胞聚集物的濾器以及將細(xì)胞排 列成單行的集中回路。MEMS裝置由振蕩器和測量位移的傳感器探針組成。振蕩器和傳感器 分別由梳陣列驅(qū)動和感測。圖版B-E示例說明了MAP系統(tǒng)的各個(gè)元件。圖版B:細(xì)胞集中 陣列。圖版C:MEMS振蕩器和傳感器。圖版D:橫梁彈簧系統(tǒng)。圖版E:振蕩器梳驅(qū)動。
[0024] 圖9示例說明了MEMS振蕩器和傳感器的簡化模型。
[0025] 圖10,圖版A-D示例說明MaPS裝置的頻率響應(yīng)研究結(jié)果。圖版A:振蕩器頻率響 應(yīng)，k2= 0. 5Nmi。圖版B:傳感器頻率響應(yīng)，k2= 0. 5Nmi。圖版C和D:適應(yīng)寬范圍的k2 值以選擇傳感器彈簧常數(shù)匕的設(shè)計(jì)研究的模擬證明。圖版C:對于一定范圍的預(yù)期傳感器 阻尼系數(shù)和設(shè)計(jì)的彈簧常數(shù)，在健康肺細(xì)胞和腫瘤肺細(xì)胞之間以500Hz致動頻率的位移分 層。圖版D:來自圖版C的水平組。
[0026] 圖11顯示傳感器電容是某些設(shè)計(jì)形式（例如設(shè)計(jì)形式2)的傳感器位移的線性函 數(shù)。然而，在某些構(gòu)型/設(shè)計(jì)中，所述關(guān)系不需要是線性的。
[0027] 圖12提供了用于控制和感測MaPS中事件的一個(gè)集成系統(tǒng)的示意圖。
[0028] 圖13示例說明了幅度調(diào)節(jié)的強(qiáng)制函數(shù)。
[0029] 圖14,圖版A-C示例說明了MaPS裝置的一個(gè)示例性但非限制性的實(shí)施方案的制造 的MEMS組件。圖版A:在單一 100mm玻璃晶片上制造的380個(gè)單獨(dú)MEMS裝置。圖版B:蝕 刻穿至玻璃的Si元件的反射光顯微鏡圖像。圖版C:MEMS裝置的掃描電子顯微鏡圖像，說 明了完整裝置和關(guān)鍵特征。
[0030] 圖15A和15B示例說明硅基底上的氧化硅蝕刻掩膜。蝕刻掩膜防止區(qū)域蝕刻；隨 后深度蝕刻去除娃，揭示了圖6所示的特征。15A的初步結(jié)果顯示于圖16。圖15A:設(shè)計(jì)1 的蝕刻掩膜。圖15B:設(shè)計(jì)3的蝕刻掩膜。
[0031] 圖16A和16B示例說明硅中蝕刻的高縱橫比特征。圖16A:圖15的掩膜區(qū)域界定 了非蝕刻區(qū)域。圖16B:蝕刻區(qū)域比掩膜區(qū)域低~42微米；通過代表性特征的輪廓測定法 評價(jià)。在實(shí)際制造方案中，粘附至玻璃的薄的（50ym厚）的Si晶片被蝕刻穿過。濕潤蝕 刻釋放從玻璃釋放移動元件，允許MEMS裝置移動。
[0032] 圖17示例說明了設(shè)計(jì)A1 (圖版a)和A2 (圖版b)的MEMS裝置層模式。
[0033] 圖18示例說明了設(shè)計(jì)A3 (圖版a)和A4 (圖版b)的MEMS裝置層模式。
[0034] 圖19示例說明了設(shè)計(jì)A5 (圖版a)和A6 (圖版b)的MEMS裝置層模式。
[0035] 圖20A和20B示例說明了可獲自不同梳角度的梳驅(qū)動陣列的力的分析。0 =0° 取向等同于縱取向，并且90°是橫取向。我們選擇了 30°取向，因?yàn)檫@能夠使90度位移加 倍，還可以實(shí)現(xiàn)比0度設(shè)計(jì)多很多倍的力，跨越位移范圍（y軸）。圖20A:所有梳角度0-90° 的研究。鋸齒邊緣是達(dá)到最大位移的地方。圖20B:0°、30°和90°設(shè)計(jì)的水平組。
[0036] 圖21顯示了振蕩探針的重力偏轉(zhuǎn)（單位mm)。最大偏轉(zhuǎn)是小的（<50nm)，并且不 會降低性能。
[0037] 圖22顯示了在2641Hz的第一共振結(jié)構(gòu)方式。通過FEA評估的該值良好匹配動力 學(xué)的第一原理分析（數(shù)據(jù)未顯示）。該系統(tǒng)通常不受接近2600Hz的信號的驅(qū)動，所以未激 發(fā)共振方式。
[0038]圖23示例說明了減小尺寸的模型梳驅(qū)動系統(tǒng)的指之間的靜電場強(qiáng)度。場強(qiáng)度作 為立方函數(shù)衰減，因此閉合梳產(chǎn)生了比僅遠(yuǎn)離一點(diǎn)的梳顯著更大的場強(qiáng)度。
[0039] 圖24A和24B不例說明了梳驅(qū)動系統(tǒng)的代表性頻率響應(yīng)曲線（以dB的幅度）。該 曲線提供了針對不同的細(xì)胞模量，靜電強(qiáng)制信號和傳感器探針位置之間的頻率響應(yīng)。100% 是健康細(xì)胞，不同的水平組是健康模量的百分比。圖24B是圖24A部分的放大。驅(qū)動信號 具有在大約400Hz處的第一諧振頻率以及來自場外0. 5MHz運(yùn)載頻率的第二諧振頻率，并且 將顯著衰減。
[0040] 圖25示例說明了如本文描述的MEMS裝置的一個(gè)制造方案。
[0041] 圖26示例說明了如本文描述的MEMS裝置的簡化制造方案。簡化程序不具有蝕刻 進(jìn)入玻璃基底的通道。在某些實(shí)施方案中，可以提供玻璃中的通道以從玻璃基底釋放MEMS 裝置的移動特征（這將允許HF酸更快速地移動進(jìn)入腔并蝕刻玻璃/Si界面）。
[0042] 圖27示例說明了振蕩器的第一共振方式的FEA預(yù)測（DV1)。
[0043] 圖28示例說明了振蕩器力作為振蕩器位置函數(shù)的第一原理和相應(yīng)的FEA預(yù)測 (DV1) 〇
[0044] 圖29顯示了MEMS振蕩器在128Hz處的周期（DV1)。
[0045] 圖30,圖版A和B顯示了MEMS振蕩器頻率響應(yīng)數(shù)據(jù)（DV1)。圖版A:128Hz的基本 驅(qū)動頻率所需的時(shí)間信號的傅里葉轉(zhuǎn)化，具有2A= 3. 5V的正弦幅度。圖版B:測試的每個(gè) 基本頻率的傅里葉轉(zhuǎn)化的最大頻率分量的幅度。數(shù)據(jù)通過F(co) 〇cV2(Q)標(biāo)準(zhǔn)化。系統(tǒng) 是非常線性的，如通過對由單一曲線參數(shù)化的所有操作幅度的數(shù)據(jù)證明的。
[0046] 圖31，圖版A和B示例說明了旁路陣列細(xì)胞集中設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)。圖版A:對于不同流 速，旁路陣列入口和出口中沿通道寬度的細(xì)胞位置。在9yL/小時(shí)，分布顯著狹窄（N=樣 品大??；s=標(biāo)準(zhǔn)偏差）。*指示標(biāo)準(zhǔn)偏差的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異；通過Levine檢驗(yàn)，p〈0. 05。 圖版B:測量的細(xì)胞速度。平均細(xì)胞將接收每次通過1. 5振蕩器擊中；平均y= 4921ym/ sec〇
[0047] 圖32示例說明用于實(shí)現(xiàn)傳感器靈敏度和傳感電容范圍的各個(gè)設(shè)計(jì)參數(shù)。表2給 出每個(gè)設(shè)計(jì)的尺寸。注意，參數(shù)"葉"規(guī)定了振蕩器或傳感器每側(cè)的葉（橫梁對）的數(shù)目。 在示例性實(shí)