例中，振蕩器和傳感器每側(cè)具有2葉。設(shè)計B5對于傳感器具有三葉。
[0048] 圖33,圖版A-C示例說明候選測試材料和預(yù)測的傳感器頻率響應(yīng)。圖版A:癌癥測 試材料和預(yù)期傳感器位移的實例。圖版B:MSC和分化譜系。圖版C:聚合物測試材料。注 意，y軸在圖版C中的對數(shù)級。表3給出a-c來源。
[0049] 圖34示例說明了幅度調(diào)節(jié)的余弦波，具有脈沖函數(shù)運載波。
[0050] 圖35示例說明了粘性介質(zhì)中角度梳驅(qū)動的模型。基本的質(zhì)量-彈簧-阻尼器振 蕩器模型通過外源靜電力作用。靜電力F(x，t)是時間和位置的函數(shù)，其中所述力的方向為 廣義坐標(biāo)x(t)。F(x，t)分解為作用于梳的切向F| |和垂直F丄力分量。垂直于F(x，t)的 力理論上等于零，因為驅(qū)動圍繞中心線是對稱的。
[0051]圖36A和36B。粘性介質(zhì)中振蕩器的線性動力學(xué)。圖36A)阻尼系數(shù)、G和無量綱 帶寬之間存在大致反相關(guān)。曲線被重作為對數(shù)-對數(shù)曲線以證明兩個可操作范圍?？?氣或真空中的振蕩器在弱阻尼區(qū)域內(nèi)操作良好，其中G<10 1和帶寬對G極大不敏感。水 下振蕩器在GG(5，15)范圍內(nèi)操作，其中G有害地影響可操作的頻率范圍。圖36B)彈 簧常數(shù)和帶寬之間存在大致線性關(guān)系。粘性阻尼改變了線性關(guān)系的斜率。邏輯上，當(dāng)阻尼 最小時更容易實現(xiàn)較大帶寬。實施例中詳細(xì)描述的設(shè)計具有b~1.25x10 3yNsecym1 的阻尼。
[0052] 圖37A和37B示例說明了位移最大化的非線性靜態(tài)力優(yōu)化。圖37A)其中 k-lOiiNym1并且0 =20°的設(shè)計的（6)的平衡的證明。彈簧力與位移大致線性比例，而 靜電力作為三次多項式成比例。對于存在兩個平衡，一個穩(wěn)定并且一個 不穩(wěn)定。隨著電壓向V_增加，兩個平衡集中于單個位移1_，其是給定設(shè)計的理論最大的 靜態(tài)位移。圖37B)存在對于任何給定k最大化位移1_的最佳0 _。隨著彈簧常數(shù)增加， 梳驅(qū)動必須產(chǎn)生在約束之內(nèi)的較大力，并且因此9必須較大。
[0053] 圖38示例說明了對于模擬的所有候選設(shè)計的方程（9)的參數(shù)大小范圍。
[0054] 圖39A-39C示例說明了水下振蕩器（9)的運動方程的傅里葉系列溶液。圖39A) 振蕩器以不同的頻率《響應(yīng)于應(yīng)用的電壓時間軸通過頻率標(biāo) 〇 準(zhǔn)化。圖39B)水下振蕩器作為頻率函數(shù)的最大位移和相位移。幅度和頻率的標(biāo)準(zhǔn)定義不 適用于非線性系統(tǒng)；這里，我們利用來自圖39A的最大位移和標(biāo)準(zhǔn)化時間位移（x_(co)和 0(?)。圖39C)可以通過以高頻率調(diào)節(jié)蘿來維持跨大頻率范圍的大位移。我們證明了可 以高頻率（>lkHz)實現(xiàn)大位移（>9iim)的特定水下振蕩器設(shè)計。
[0055] 圖40A和40B示例說明在大于1kHz的頻率大于5ym的位移的設(shè)計參數(shù)k和0 的優(yōu)化。圖40A)給定k和致動頻率co的可實現(xiàn)的x_位移。圖40B)給定k和致動頻率 ?的最佳驅(qū)動角度0 _。
[0056] 圖41不意說明MEMS制造中的主要石印步驟。1)將Si晶片陽極結(jié)合至玻璃晶片。 2)將Si側(cè)變薄至50ym。5)設(shè)置金接觸墊。7)設(shè)置Si02蝕刻掩膜。8)DRIE蝕刻Si元件。 10)釋放具有定時HF蝕刻的移動元件。
[0057] 詳述
[0058] 為了給大群體內(nèi)個體細(xì)胞的機械表型帶來前所未有的檢測速度和全面的群統(tǒng)計， 提供了機械表征和分選（MaPS)平臺。該微流體平臺具有基于探針的檢測，用于快速測量流 動下的細(xì)胞。在某些實施方案中，MaPS集成了微流體網(wǎng)絡(luò)與原位機械探針和傳感器，用于 直接測量個體細(xì)胞的彈性模量。而其他機械表型化裝置需要計算機密集的圖像分析，細(xì)胞 粘附至基底，或者僅提供定性的對比的"變形性"數(shù)據(jù)，本文描述的MaPS裝置是即插即用 裝置，具有不需要熒光標(biāo)記的定量讀出器。因此，MaPS具有定量測定個體細(xì)胞水平的癌癥 治療效力的極大潛力。重要的是，MaPS可以適于考察細(xì)胞的其他物理屬性，例如其電性質(zhì) 或響應(yīng)于施加的變形的松弛行為。
[0059] 在某些實施方案中，本文描述的MaPS裝置中的檢測機制是基于模擬信號加工， 并因此非?？焖?。活動分選機制可直接整合進(jìn)入該裝置，以通過基于細(xì)胞的變形性/模 量而做出決定并然后快速地適當(dāng)激活分選器而將細(xì)胞快速分選進(jìn)入多個亞群之一。除了 篩選化療藥物文庫之外，最近結(jié)果表明，細(xì)胞變形性/彈性模量可用于分級卵巢癌細(xì)胞系 的轉(zhuǎn)移潛力（Xu等人（2〇12)PL〇SONE7(10) :e466〇9;Swaminathan等人（2〇l2)Cancer Res. 71 (15) :5075-5080)。較軟的惡性細(xì)胞比較硬的惡性細(xì)胞更具侵入性（同上）。不受 特定理論束縛，認(rèn)為這些發(fā)現(xiàn)具有直接的功能關(guān)聯(lián)，因為較軟的細(xì)胞可以更容易穿過曲折 的血管和淋巴網(wǎng)絡(luò)而接種在第二部位。
[0060] 對于橫穿濾器的細(xì)胞以及隨后通過顯微鏡評價，侵入測定通常需要至少數(shù)個小 時。相反，使用本文描述的MaPS裝置評價相同樣品體積需要僅數(shù)分鐘。MaPS還獨特地能 夠評價贅生物內(nèi)個體癌癥細(xì)胞的機械性質(zhì)的不均一性。此類表型多樣性可以提供預(yù)測力 (Calbo等人（2011)CancerCell, 19 :244-256)。而且，已經(jīng)顯示對病理學(xué)例如瘧疾（Bow等 人（2011)LabonaChip, 11 :1065-1073)和鐮狀細(xì)胞性貧血（Higgins等人（2007)卩『〇(：. Natl.Acad.Sci.USA，104 :20496-20500)的不同機械簽名。干細(xì)胞在分化期間還經(jīng)歷了其 分子組成的顯著變化，并且這些變化是通過其機械性質(zhì)可測量的（Pajerowski等人（2007) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 104 :15619-15624)。存在極大前景：描述的MaPS也用于診斷和 評價這些病理和生理轉(zhuǎn)化。
[0061] 高通量的機械表銦化
[0062] 在各個實施方案中，本文描述的MaPS系統(tǒng)允許以每秒大于約102個細(xì)胞/秒、或 大于約1〇3個細(xì)胞/秒、或大于約10 4個細(xì)胞/秒的速率機械表型化。通量可以放大，例如 通過使用多個通道，并且認(rèn)為大于約1〇5個細(xì)胞/秒、或大于約1〇 6個細(xì)胞/秒、或大于約 1〇7個細(xì)胞/秒、大于約10 8個細(xì)胞/秒的能力是可實現(xiàn)的。這有利于快速且有效評價機械 表型是不同環(huán)境中細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)的標(biāo)志物的程度。
[0063] 為了實現(xiàn)該目的，在某些實施方案中，MaPS將活動微電子機械系統(tǒng)（MEMS)與振蕩 器和傳感器探針集成進(jìn)入微流體裝置（參見例如，圖4和圖8)。本文描述的方法構(gòu)建于探測 細(xì)胞彈性模量的現(xiàn)有方法的強度。然而，本文描述的MaPS系統(tǒng)實現(xiàn)了個體細(xì)胞的靈敏的力 探針測量和通過連續(xù)流動細(xì)胞經(jīng)過微流體網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的力探針而探測大量細(xì)胞的能力?，F(xiàn)有的 基于探針的方法，例如AFM，用于獲得固定就位的個體細(xì)胞的力變形響應(yīng)的精確測量。另一 方面，微流體裝置能夠具有更高檢測速率，但是缺乏機械測量中的定量精確度。例如，可以 通過流動細(xì)胞經(jīng)過微流體裝置的狹窄束縛（Rowat等人（2013)J.Biol.Chem.doi: 10. 1074/ jbc.M112. 441535)(參見例如，圖2A-2C)，或者通過使它們以升高的流動慣性經(jīng)受流體相 互作用產(chǎn)生的力（Hur等人（2011)LabonaChip, 11 :912-920)，而探測超過500細(xì)胞的變 形性。雖然基于流動的方法可以實現(xiàn)超過1〇2個細(xì)胞/秒的檢測速率（同上），但是這些方 法取決于不可實時實現(xiàn)的計算機密集的圖像加工。
[0064] 相反，MaPS開發(fā)了細(xì)胞通過微流體裝置通道的流動，以及處理模擬信號數(shù)據(jù)的基 于MEMS的測量系統(tǒng)，并且可以因此以103個細(xì)胞/秒的顯著更高的檢測頻率操作。以與 FACS相當(dāng)?shù)臋z測速率，該新的機械表型化方法在癌癥預(yù)后和治療以及其他環(huán)境中具有廣泛 應(yīng)用性。
[0065] 開發(fā)微流體通道中的流動以橾棹細(xì)朐
[0066]MaPS開發(fā)了通過微流體通道的流動以前所未有的速率移動細(xì)胞經(jīng)過力和傳感器 探針。MaPS的主要流體管線是細(xì)胞流動通道（參見例如，圖4)。經(jīng)過流動通道的細(xì)胞流 動和振蕩器探針和傳感探針（例如，如下所述）測量了細(xì)胞對所應(yīng)用力的機械響應(yīng)。
[0067] 可以通過測量校準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)的位移來計算軟材料例如細(xì)胞的順從性，具有與測試材 料接觸相似的順從性。在靜態(tài)接觸中，細(xì)胞的相對位移8。和校準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)Ss實現(xiàn)為位移除 法器：
[0068]
[0069] 其中位移比率是兩種材料的有效彈簧常數(shù)匕和ks的反比。彈簧常數(shù)采取幾何和 材料模量。校準(zhǔn)的橫梁結(jié)構(gòu)具有用于有效彈簧常數(shù)計算的良好確定的模型。細(xì)胞是較不直 接向前的。在一個示例性方法中，線性化的赫茲接觸模型（Landau和Lifshits,Theoryof Elasticity:PergamonPress, 1965)(與平板接觸的彈性球）從細(xì)胞模量推導(dǎo)有效的彈簧 硬度，并且還假定細(xì)胞響應(yīng)取決于接觸速度，采取kelvin-voigt模型的形式（圖9)。
[0070] 類似于許多常見的機械表型化方法，MaPS通過使細(xì)胞偏離校準(zhǔn)的探針而檢測細(xì)胞 機械表型。主要的檢測機制是微電子機械系統(tǒng)（MEMS)探針。通過模擬不同的設(shè)計參數(shù)，在 某些實施方案中，選擇的MEMS設(shè)計加入了置于微流體通道相對側(cè)的兩個探針（參見例如， 圖4)。在一側(cè)，振蕩探針以大約200Hz至2kHz、或從約300Hz至約1kHz、或從約400Hz至約 600Hz以及在某些實施方案中以大約500Hz的頻率和從約4至約25ym或從5至約10ym以及在某些實施方案中約10ym的位移振蕩。直接相反，轉(zhuǎn)向?qū)娭戚斎肜鐚?00Hz強 制輸入敏感的位移傳感器測量了迫使細(xì)胞進(jìn)入傳感器的振蕩器所施加的位移。當(dāng)參考這些 分量時，本文使用振蕩器和傳感器。
[0071] 在各個實施方案中，振蕩器探針以如下頻率振蕩：使得穿過細(xì)胞在細(xì)胞流經(jīng)探針 接口期間在簡短的~10msec時間段內(nèi)被探測多（例如，大約1-5)次。在缺乏任何細(xì)胞時， 進(jìn)入流體填充的通道的振蕩器探針的位移將簡單地迀移流體。然而，當(dāng)細(xì)胞穿過探針接口 時，移動的振蕩器探針產(chǎn)生的力將通過細(xì)胞傳遞至相對的傳感探針；傳感探針的得到的位 移將取決于穿過細(xì)胞的彈性模量。
[0072] 可以通過使用注射器（或其他）栗調(diào)節(jié)懸浮細(xì)胞密度和流體流速來調(diào)節(jié)細(xì)胞檢測 頻率。操縱細(xì)胞通過微米級通道的流動也提供了對MEMS裝置的探針接口的供檢測的細(xì)胞 位置的精密控制。在某些實施方案中，鞘流動可用于將細(xì)胞匯集成單一流線，供本文描述的 系統(tǒng)中檢測。
[0073]kHz檢測諫率的力探針
[0074] 在某些實施方案中，用于驅(qū)動和感測的兩個探針使用交錯的梳指或梳驅(qū)動的陣 列。為了致動探針，跨梳對施加電壓（電勢）以產(chǎn)生吸引力。為了作為位置傳感器操作，位 置依賴性電容可以跨梳對測量。驅(qū)動探針和傳感器探針都可以通過細(xì)長的橫梁彈簧返回其 中性位置（參見例如，圖4-8)。橫梁構(gòu)造可以被設(shè)計為僅允許沿著運動方向并且不明顯以 垂直框移動。在各個實施方案中，完整MEMS裝置可以從單個裸片的（例如摻雜硅）微機械 加工。為了實現(xiàn)快速檢測，振蕩器的位置可以例如如上所示500Hz的基本頻率驅(qū)動。
[0075] 完整的振蕩器、傳感器和細(xì)胞系統(tǒng)可以通過假定振蕩器和傳感器各自用作質(zhì)量、 彈簧、阻尼器系統(tǒng)并且細(xì)胞用作kelvin-voigt材料而模擬（參見例如，圖9)。振蕩器和傳 感器各自通過其各自彈簧固定于固體基底，并且通過應(yīng)用的外部力驅(qū)動振蕩器。振蕩器和 傳感器的彈簧常數(shù)和質(zhì)量可以通過調(diào)節(jié)探針幾何來設(shè)計。在預(yù)期的驅(qū)動頻率范圍評價振蕩 器/細(xì)胞/傳感器系統(tǒng)的頻率響應(yīng)以指導(dǎo)設(shè)計。
[0076]MaPS的一個考慮的應(yīng)用是高通量診斷贅生細(xì)胞（腫瘤或非腫瘤癌細(xì)胞）。在該背 景下，一個重要的量度是在大約例如500Hz的頻率下健康細(xì)胞和贅生細(xì)胞之間傳感器位移 信號的估計的分層（Cross等人（2010)NatureNanotechnology, 2 :780_783)。圖 10,圖版 A示例說明了k2= 0. 5Nm1的振蕩器頻率響應(yīng)，而圖10,圖版B示例說明了k2= 0. 5Nm1 的傳感器頻率響應(yīng)。圖10,圖版C和D示例說明了如從之前設(shè)計重復(fù)經(jīng)驗確定的預(yù)期阻尼 系數(shù)范圍內(nèi)彈簧常數(shù)k2的設(shè)計空間。傳感器位移是小的，并且因此傳感器保真度是重要的。 k2= 0.50Nm1的傳感器彈簧常數(shù)產(chǎn)生了足以分辨細(xì)胞機械表型的頻率帶寬和測量分層。
[0077]MEMS組件
[0078]振蕩器和傳感器
[0079] 在一個示例性實施方案中，振蕩器和傳感器是結(jié)合至玻璃基底的低電阻硅的單個 裸片的蝕刻形式?？梢苿拥慕Y(jié)構(gòu)被穿孔以允許移動元件通過下面的玻璃基底的定時酸蝕刻 而從玻璃基底釋放。大的單塊結(jié)構(gòu)（例如，>20ym特征尺寸）維持結(jié)合至玻璃。在一個實 施方案中，每個彈簧包括從硅切割的八個細(xì)長橫梁，并且橫梁系統(tǒng)被設(shè)計具有指定的彈簧 常數(shù)。
[0080] 振蕩器和傳感器可以被梳指形式的平行板陣列驅(qū)動和感測。陣列例如這些 所謂的梳驅(qū)動是MEMS致動器和傳感器中常見的（Dong等人（2007)J.Micromechanics Microengineering，17 :154-1161;Sun等人（2002)SensorsandActuatorsA，102 :49_60 ; Sun等人（2002)J.MicromechanicsMicroengineering，12:832-840)。通過跨梳對施加電 壓電勢而驅(qū)動致動器，以產(chǎn)生吸引的靜電力；通過測量電容變化而感測位移。有兩個基本設(shè) 計：1)縱向設(shè)計（9 =0°，圖8,圖版E)其中移動的梳橫跨平行于梳面，和2)橫向設(shè)計（0 = 90°，圖8圖版E)其中移動的梳橫跨垂直于梳面。特征上，縱向驅(qū)動應(yīng)用比橫向驅(qū)動相 對較弱的力，但實現(xiàn)了相對較高的位移。在某些實施方案中，MaPs裝置中使用的振蕩器設(shè) 計是縱向和橫向設(shè)計的雜合體，9范圍從約5°至約40°、或從約10°至約30°、或從約 15°至約25。。在一個示例性但非限制性實施方案中，9 = 20。（圖Error!Reference sourcenotfound.，圖版E)。該構(gòu)型實現(xiàn)了大位移（比橫向設(shè)計近3x更大的范圍）和高 力（在中性位置比縱向設(shè)計2. 5x更大，并且在完全位移時25x更大）。而且，導(dǎo)致橫向設(shè) 計中有害的"拉入"不穩(wěn)定性的位移依賴性非線性顯著減少（Sun等人（2002)Sensorsand ActuatorsA, 102 ：49-60)〇
[0081] 傳感器可以具有縱向梳陣列設(shè)計，因為在某些實施方案中，傳感器彈簧k2被設(shè) 計為比振蕩器更弱的幅度級別以感測軟的細(xì)胞材料，并且電容測量回路利用的信號（例 如，100kHz方波信號）可以在某些實施方案中對傳感器施加小力?？v向設(shè)計最小化所述 力。傳感器電容是傳感器位移的線性函數(shù)（參見例如，圖11)。一個示例性的電容傳感器 (MS3110BDPC-USB,IrvineSensors,Irvine,CA)具有大約 89aF的分辨率，提供了大約 1400 個管線的分辨率，用于區(qū)分癌細(xì)胞與健康細(xì)胞，通過圖11和圖10,圖版B中的分析圖。
[0082] 微流體網(wǎng)絡(luò)
[0083]MEMS振蕩器和傳感器通常集成入微流體網(wǎng)絡(luò)。設(shè)計微流體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行兩個功能：1) 將單行細(xì)胞流遞送至MEMS裝置供測量，和2)將振蕩器和傳感器電子儀器浸入水（例如，去 離子水）中，伴隨水和細(xì)胞介質(zhì)的最小混合。在某些示例性但非限制性實施方案中，微流體 網(wǎng)絡(luò)主要由PDMS(或其他軟石印材料）"帽"組成，具有在MEMS裝置周圍密封的減輕的通 道構(gòu)造。流體網(wǎng)絡(luò)的小部分可以通過蝕刻的硅元件確定。
[0084] 細(xì)朐介質(zhì)通道
[0085] 如圖8示例說明的，在某些實施方案中，細(xì)胞介質(zhì)通道由入口、解聚細(xì)胞團塊 并濾掉殘渣的細(xì)胞濾器、細(xì)胞集中區(qū)、遞送細(xì)胞至MEMS探針接口的收斂管道和出口組 成。細(xì)胞集中回路使用運載流體作為實際的鞘流（Aoki等人（2009)Microfluidicsand Nanofluidics，6 :571-576)。多個平行的旁路通道提取網(wǎng)絡(luò)第一半中的運載流體而非較大 的物體例如細(xì)胞，然后將提取的流體軸向再注射入網(wǎng)絡(luò)的第二半。該旁路設(shè)計有效減少 了均一分布的細(xì)胞流周圍的流體速度，然后通過垂直撞擊細(xì)胞流的低速