數(shù)祀?￥>;OV=s/品<1腑％。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段的斑馬魚肝臟面積指數(shù) 各批次間的變異系數(shù)均小于肝臟面積的批間變異系數(shù)，說明肝臟面積指數(shù)的檢測結(jié)果比肝 臟面積的檢測結(jié)果的重現(xiàn)性更佳。結(jié)果如表2所示下：
[0035]表2不同批次間斑馬魚的肝臟面積和肝臟面積指數(shù)的變異系數(shù)（％ )
[0036] CN1051巧951A 坑明書 4/13頁
[0037] 依據(jù)所建立的定量分析方法對不同發(fā)育階段的斑馬魚肝臟面積指數(shù)的生理正常 值進行檢測，結(jié)果如表3所示：
[003引表3不同發(fā)育階段的斑馬魚肝臟面積指數(shù)（％ )(n= 150)
[0039] CN1051巧951A 說明書 6/13頁
[0041] 單樣本K-S檢驗分析顯示上述各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，用之±l.%s確定95%可 信區(qū)間，確定不同發(fā)育齡正常斑馬魚肝臟面積指數(shù)的正常界值范圍為：
[0042] 受精后3d的斑馬魚肝臟面積指數(shù)為0. 40~0. 68%，受精后4d的斑馬魚肝臟面積 指數(shù)為1. 99~2. 66%，受精后5d的斑馬魚肝臟面積指數(shù)為3. 07~3. 82 %，受精后6d的斑 馬魚肝臟面積指數(shù)為3. 93~4. 84%，受精后的7d斑馬魚肝臟面積指數(shù)為3. 25~4. 39%。
[0043] 通過待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數(shù)與上述正常斑馬魚肝臟面積指 數(shù)進行比較，得出待測化合物是否對斑馬魚肝臟功能有損傷的結(jié)果。 W44] 有益效果 W45] 1、本發(fā)明首次將肝臟面積指數(shù)作為斑馬魚肝功能評價的檢測指標，更加科學、客 觀，提高了結(jié)果的準確性。建立的化合物對斑馬魚肝功能損傷作用的評價模型具有制作簡 單、快速、穩(wěn)定可靠和重復性好的優(yōu)點。
[0046] 2、本發(fā)明中所用的模式生物斑馬魚，既具有體外細胞株可快速篩選的優(yōu)點，又具 有活體動物體內(nèi)驗證的優(yōu)勢，利用斑馬魚胚胎進行大規(guī)?；衔锏母闻K毒性評價，有助于 提高實驗效率和降低實驗成本。
【附圖說明】
[0047] 圖1為甲糞威對斑馬魚肝功能損傷的肝臟巧光照片； W48] 圖中：a為空白對照組；b為15iiM的甲糞威處理組；圖中劃線部分為肝臟。 W例 圖2為斑馬魚肝臟組織切片她染色）照片。 陽化0] 圖中：a為空白對照組斑馬魚肝臟組織切片照片；b為15yM的甲糞威處理組斑馬 魚肝臟組織切片照片；
[0051] 圖3為異煙阱對斑馬魚肝功能損傷的肝臟巧光照片； 陽05引圖中：a為空白對照組；b為16mM的異煙阱處理組；圖中劃線部分為肝臟。
[0053] 圖4為斑馬魚肝臟組織切片（肥染色）照片。
[0054] 圖中：a為空白對照組斑馬魚肝臟組織切片照片；b為16mM的異煙阱處理組斑馬 魚肝臟組織切片照片； 陽化5] 圖5為化嗦酷胺對斑馬魚肝功能損傷的肝臟巧光照片；
[0056] 圖中：a為空白對照組；b為5mM的化嗦酷胺處理組；圖中劃線部分為肝臟。
[0057] 圖6為斑馬魚肝臟組織切片（肥染色）照片；
[005引圖中：a為空白對照組斑馬魚肝臟組織切片照片；b為5mM的化嗦酷胺處理組斑馬 魚肝臟組織切片照片。
【具體實施方式】
[0059] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于 此。
[0060] 實驗動物：采用肝臟特異表達巧光的斑馬魚，購自國家斑馬魚資源中屯、。雌雄斑馬 魚在照明14h/黑暗10h、28°C標準條件下分開飼養(yǎng)，定時喂W顆粒狀巧料和豐年郵。用卵 時，取健康性成熟的斑馬魚，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸內(nèi)，中間放置隔板，置于黑 暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小時后將成魚拱出，使排卵時間控 制在半小時內(nèi)，W降低胚胎間發(fā)育時間的差異。收集受精卵，對受精卵進行消毒和清洗后， 移入斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水中，28°C下控光培養(yǎng)，中間每24h換約1/2水，并及時吸出死亡胚 胎。
[0061] 試劑配制：甲糞威標準品購自上海市農(nóng)藥研究所，用二甲基亞楓溶解配制儲液。異 煙阱（INH，CAS號 54-85-3)購自Fluka公司、化嗦酷胺（PZA，CAS號 98-96-4)購自Sigma 公司，分別用純水溶解配制儲液。所有樣品儲液放于4°C保存，實驗時用培養(yǎng)水稀釋至所需 濃度。
[0062] 培養(yǎng)水組分如下：
[0063] NaCl5mM，KC1 0. 17mM，CaClz0. 4mM，M拆〇40. 16mM，去離子水配制。
[0064] 實施例1 :評價甲糞威對斑馬魚肝臟的毒性作用 陽0化]1.斑馬魚幼魚的獲得與使用
[0066] 采用健康性成熟的肝臟特異表達巧光的斑馬魚，按雌雄1/1或1/2的比例放入交 配缸內(nèi)，中間放置隔板，置于黑暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小時 后將成魚拱出，使排卵時間控制在半小時內(nèi)，W降低胚胎間發(fā)育時間的差異。收集受精卵， 對受精卵進行消毒和清洗后，移入斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水中，并向所述培養(yǎng)水中加入0.化pm 亞甲基藍，28°C下控光培養(yǎng)。從斑馬魚胚胎出生后12小時加入0. 2mM的苯硫脈，中間每24h 換約1/2水，并及時吸出死亡胚胎。將出生后3天的斑馬魚置于解剖鏡下，選取發(fā)育正常的 斑馬魚仔魚，放入6孔板中，每孔10尾，每組3個平行孔。
[0067] 2.化合物處理
[0068] 設置7個實驗組：1個空白對照組，1個溶劑對照組，5個甲糞威處理組。移除微孔 板中的培養(yǎng)水，空白對照組中加入5血培養(yǎng)水，溶劑對照組加入5血含體積濃度0. 5%二甲 基亞諷的培養(yǎng)水溶液，甲糞威處理組分別加入5血濃度為5yM，10yM，15yM，20yM，30yM 的甲糞威溶液。然后，放入28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。每24h換液一半。 W例 3.定量分析
[0070] 于施藥后72小時，將斑馬魚用質(zhì)量濃度為0. 3%。的S卡因麻醉Imin，然后用3%甲 基纖維素固定于載玻片上，將斑馬魚固定側(cè)面體位進行拍照。
[0071] 巧光顯微鏡下拍照記錄斑馬魚肝臟巧光情況。與空白對照組和溶劑對照組相比， 甲糞威處理后的幼魚肝組織巧光面積和巧光強度明顯下降，肝臟明顯萎縮退化（圖1)。
[0072] 利用圖像處理軟件計算所述模型的肝臟面積、體面積。
[0073] 根據(jù)如下公式計算各組斑馬魚的肝臟面積指數(shù)：
[0074] 肝臟面積指數(shù)=肝臟面積/體面積X 100%
[00巧]各組斑馬魚肝臟面積指數(shù)表示，采用獨立樣本t檢驗法分析比較組間差異 的顯著性。
[0076] 統(tǒng)計結(jié)果顯示，與空白對照組相比，5iiM的甲糞威處理組斑馬魚肝臟面積指數(shù)無 顯著性變化；10yM的甲糞威處理組斑馬魚肝臟面積指數(shù)降低，具有統(tǒng)計學意義（P<0. 05); 15yM、20yM和30yM的甲糞威處理組斑馬魚肝臟面積指數(shù)均明顯降低并具有劑量依賴 性，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<〇. 01)(表4)。
[0077] W實施例1制備的所述斑馬魚肝功能損傷評價模型為研究對象，考察本發(fā)明所述 的斑馬魚肝臟損傷的評價指標，即肝臟面積指數(shù)的降低與現(xiàn)有技術(shù)中的肝臟常規(guī)評價指標 即谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)的相關(guān)性，進一步驗證斑馬魚肝臟面積指數(shù)的降 低作為快速評價化合物對斑馬魚肝臟功能損傷作用的指標的可靠性。
[007引制備實施例1中的斑馬魚幼魚組織勻漿，測定組織中ALT、AST水平。與空白對照 組相比，5 y M的甲糞威處理組ALT、AST含量未見顯著性升高，10 y M、15 y M、20 y M和30 y M 的甲糞威處理組ALT、AST含量均顯著性升高（P<0. 05, P<0. 01)(表4)?？梢?，斑馬魚肝臟 面積指數(shù)的降低與轉(zhuǎn)氨酶生化指標升高在反映甲糞威對斑馬魚的肝臟損傷程度上具有相 關(guān)性。
[0079]表4甲糞威對斑馬魚幼魚肝臟面積指數(shù)和轉(zhuǎn)氨酶的影響（；±:s，n= 30)
[0081]沖<0. 05si即i