加入0. 2mM的苯硫脈，中 間每24小時換約1/2水，并及時吸出死亡胚胎。將出生后2天的斑馬魚置于解剖鏡下，選 取發(fā)育正常的斑馬魚仔魚，放入6孔板中，每孔10尾。每組3個平行孔。
[0123] 2.化合物處理
[0124] 設(shè)置4個實(shí)驗(yàn)組：1個空白對照組，3個化嗦酷胺處理組。移除微孔板中的培養(yǎng)水， 空白對照組中加入5血培養(yǎng)水，化嗦酷胺處理組分別加入5血濃度為ImM，2. 5mM，5mM的化 嗦酷胺溶液。然后，放入28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時。每24h換液一半。 陽125] 3.定量分析 陽126] 于施藥后72小時，將斑馬魚用質(zhì)量濃度為0.3%。的S卡因麻醉90s，然后用3%甲 基纖維素固定于載玻片上，將斑馬魚固定側(cè)面體位進(jìn)行拍照。 陽127] 巧光顯微鏡下拍照記錄斑馬魚肝臟巧光情況。與空白對照組和溶劑對照組相比， 化嗦酷胺處理后的幼魚肝組織巧光面積和巧光強(qiáng)度明顯下降，肝臟明顯萎縮退化（圖5)。
[0128] 利用圖像處理軟件計算所述模型的肝臟面積、體面積。
[0129] 根據(jù)如下公式計算各組斑馬魚的肝臟面積指數(shù)：肝臟面積指數(shù)=肝臟面積/體面 積X100%
[0130] 各組斑馬魚肝臟面積指數(shù)W x主si表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法分析比較組間差異 的顯著性。 陽131] 統(tǒng)計結(jié)果顯示，與空白對照組相比，ImM的化嗦酷胺處理組斑馬魚肝臟面積指數(shù)無 顯著性變化；2. 5mM和5mM的化嗦酷胺處理組斑馬魚肝臟面積指數(shù)均顯著性降低（P<0. 01)， 超過相應(yīng)的正常界值范圍（表9)。
[0132] W實(shí)施例3制備的所述斑馬魚肝功能損傷評價模型為研究對象，考察本發(fā)明所述 的斑馬魚肝臟損傷的評價指標(biāo)，即肝臟面積指數(shù)的降低與現(xiàn)有技術(shù)中的肝臟常規(guī)評價指標(biāo) 即谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)的相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證斑馬魚肝臟面積指數(shù)的降 低作為快速評價化合物對斑馬魚肝臟功能損傷作用的指標(biāo)的可靠性。 陽133] 制備實(shí)施例3中的斑馬魚幼魚組織勻漿，測定組織中ALT、AST水平。與空白對照 組相比，ImM的化嗦酷胺處理組ALT、AST含量均未見升高，2. 5mM和5mM的化嗦酷胺處理組ALT、AST含量均顯著性升高（P<0. 01，P<0. 05)(表9)?？梢姡唏R魚肝臟面積指數(shù)的降低與 轉(zhuǎn)氨酶生化指標(biāo)升高在反映化嗦酷胺對斑馬魚的肝臟損傷程度上具有相關(guān)性。
[0134]表9化嗦酷胺對斑馬魚幼魚肝臟面積指數(shù)轉(zhuǎn)氨酶的影響（^S，n= 30)
CN 1051巧951 A 化W書 13/13頁
[0137] *P<0.0 Ssignific曰ntly different from the control ;**P<0.0 lsignific曰ntly different from the control.
[0138] 為進(jìn)一步研究斑馬魚肝臟面積指數(shù)和轉(zhuǎn)氨酶生化指標(biāo)之間的相關(guān)性，分別在4個 實(shí)驗(yàn)組（空白對照組、ImM化嗦酷胺處理組、2. 5mM化嗦酷胺處理組和5mM化嗦酷胺處理組） 中選取3批樣本，共計12個樣本。每批30個斑馬魚，計算每批各組斑馬魚的肝臟面積指數(shù) 和轉(zhuǎn)氨酶生化指標(biāo)的平均值。采用化arson相關(guān)系數(shù)，分析肝臟面積指數(shù)與血生化指標(biāo)之 間的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：P〈〇. 05。
[0139] 化arson相關(guān)系數(shù)計算公式如下：
陽相關(guān)性分析表明，斑馬魚肝臟面積指數(shù)與ALT、AST水平之間均呈負(fù)相關(guān)，均存在 非常強(qiáng)的相關(guān)性（IrI〉0.8，P<0.01)。如表10所示：
[0142]表10肝臟面積指數(shù)與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)的相關(guān)性
[0144] 對正常組和化嗦酷胺處理組斑馬魚做病理切片和肥染色，結(jié)果顯示，正常斑馬魚 幼魚肝臟結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞質(zhì)均勻紅染?；驴岚诽幚戆唏R魚7化后，ImM處理組斑馬魚的 肝細(xì)胞未發(fā)生明顯變化，2. 5mM、5mM處理組斑馬魚幼魚部分肝細(xì)胞輪廓不清晰，出現(xiàn)大量空 泡，胞質(zhì)稀疏（圖6)。
[0145] 在本方法中，經(jīng)化嗦酷胺化5mM、5mM)處理后斑馬魚的肝臟面積指數(shù)顯著下降， 并超過相應(yīng)的正常界值范圍，結(jié)合轉(zhuǎn)氨酶和肝臟組織病理切片結(jié)果，表明化嗦酷胺具有肝 臟毒性作用，同時也證明肝臟面積指數(shù)的降低可作為快速評價化合物對斑馬魚肝功能損傷 作用的評價指標(biāo)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速評價化合物對斑馬魚肝臟功能損傷作用的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 將受精后2~4天的發(fā)育正常斑馬魚胚胎移入培養(yǎng)孔中； (2) 對培養(yǎng)孔中的斑馬魚胚胎連續(xù)給藥孵育1~3天，記為待測化合物組； (3) 觀察斑馬魚胚胎肝臟，記錄并計算斑馬魚胚胎肝臟面積和斑馬魚胚胎體面積，按照 如下公式計算肝臟面積指數(shù)： 肝臟面積指數(shù)=肝臟面積/體面積X 100% ; (4) 當(dāng)步驟（3)計算的待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數(shù)不在正常斑馬魚胚 胎的肝臟面積指數(shù)的范圍內(nèi)，且達(dá)到統(tǒng)計學(xué)上的顯著性水平（P〈〇. 05)，則待測化合物具有 肝臟毒性；當(dāng)步驟（3)計算的待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數(shù)在正常斑馬魚胚 胎的肝臟面積指數(shù)范圍內(nèi)，則待測化合物不具有肝臟毒性； 所述的正常斑馬魚胚胎的肝臟面積指數(shù)為： 受精后3d的斑馬魚肝臟面積指數(shù)為0. 40~0. 68 %，受精后4d的斑馬魚肝臟面積指數(shù) 為1. 99~2. 66%，受精后5d的斑馬魚肝臟面積指數(shù)為3. 07~3. 82 %，受精后6d的斑馬 魚肝臟面積指數(shù)為3. 93~4. 84%，受精后的7d斑馬魚肝臟面積指數(shù)為3. 25~4. 39%。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述斑馬魚胚胎為肝臟特異表達(dá)熒光的斑 馬魚胚胎。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中斑馬魚胚胎為受精3~6天 的斑馬魚胚胎。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中孵育，溫度為26~30°C，光 照孵育，每天更換含待測化合物的培養(yǎng)液。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液組分如下： NaCl 5mM，KCl 0? 17mM，CaCl2 0? 4mM，MgSO4 0? 16mM，去離子水配制。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)還包括觀察前的預(yù)處理步驟、； 將需要觀察的斑馬魚胚胎用質(zhì)量濃度為〇. 3%。的三卡因浸泡40~90s進(jìn)行麻醉，然后用 3%甲基纖維素固定于載玻片上。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)的觀察為在熒光顯微鏡下觀 察。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)的記錄為拍照記錄。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)的計算為利用圖像處理軟件計 算。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中，待測化合物組至少做三組 平行實(shí)驗(yàn)，每組斑馬魚胚胎總數(shù)不低于15枚；進(jìn)一步優(yōu)選的，每組斑馬魚胚胎總數(shù)為30~ 50枚。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速評價化合物對斑馬魚肝臟功能損傷作用的方法，包括如下步驟：(1)將受精后正常斑馬魚胚胎移入培養(yǎng)孔中；(2)對培養(yǎng)孔中的斑馬魚胚胎連續(xù)給藥孵育，記為待測化合物組；(3)觀察斑馬魚胚胎肝臟，記錄并計算斑馬魚胚胎肝臟面積和斑馬魚胚胎體面積；(4)根據(jù)待測化合物組的斑馬魚胚胎的肝臟面積指數(shù)與正常斑馬魚胚胎的肝臟面積指數(shù)的范圍的關(guān)系，判斷待測化合物是否具有肝臟毒性；本發(fā)明首次將肝臟面積指數(shù)作為斑馬魚肝功能評價的檢測指標(biāo)，更加科學(xué)、客觀，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。建立的化合物對斑馬魚肝功能損傷作用的評價模型具有制作簡單、快速、穩(wěn)定可靠和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105115951
【申請?zhí)枴緾N201510487139
【發(fā)明人】張?jiān)? 劉可春, 韓利文, 王雪, 何秋霞, 孫晨, 王希敏, 楚杰, 韓建, 王榮春
【申請人】山東省科學(xué)院生物研究所
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月10日