一種使用專屬性肽段組鑒別梅花參的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種使用專屬性膚段組鑒別梅花參 (Thelenotaananas)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 海參富含酸性黏多糖，對人體有免疫調(diào)節(jié)劑、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。 故此，海參享有"營養(yǎng)寶庫"之美譽，現(xiàn)代人把海參譽為"海味八珍之首"。市場上海參種類 繁多，不同海參因其營養(yǎng)價值、口感等不同而價格相差巨大，梅花參（Thelenotaananas)同 灰刺參一樣經(jīng)濟價值很高，既是滋補品，又可治病抗癌，有一定的防衰老作用，含有較高的 蛋白質(zhì)，礦物質(zhì)也較豐富，并且不含膽固醇，是理想的滋補品。中醫(yī)認(rèn)為：海參性溫，味成，有 補腎益精、養(yǎng)血潤燥之功，可W治精血虧損、虛弱勞怯、陽瘦、腸燥便艱等癥。對于產(chǎn)后、病后 體虛衰老，肺結(jié)核，神經(jīng)衰弱等癥，均可用之。
[0003] 不同品種的海參相比較，有的粘多糖含量高，對屯、腦血管有好處；有的皂武含量 高，對抗癌有益。海參同人參一樣，如果皂武含量高，則藥用價值高，但可能味道不好；而有 的海參蛋白質(zhì)含量高，如茄參和刺參，可W大量用在賓館和家庭餐桌上，對蛋白質(zhì)缺乏、營 養(yǎng)不良的人群提供身體所需的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0004] 由于目前缺乏特別有效的識別海參品種的方法，鑒別海參種類的方法還只是靠傳 統(tǒng)的外觀觀察，缺乏技術(shù)水平的支持，導(dǎo)致不少不良商人W次充好、W假充真欺騙消費者， 因此需要一種高效準(zhǔn)確的鑒定海參的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明對梅花參（Thelenotaananas)的多膚進行了研究，建立了從多膚水平對梅 花參進行鑒別的技術(shù)，填補了國內(nèi)外海參鑒別的空白。
[0006] 本發(fā)明首先設(shè)及一組用于單獨或組合檢測梅花參的多膚，所述的多膚的序列為：
[0007] 沈QIDNO. 1:ADIAEDSLK;
[0008] 沈QIDNO. 2:AGPAGDDAPR;
[0009] 沈QIDNO. 3:MPIPLLEGK;
[0010] 沈QIDNO. 4 :LDIPLLEGK。
[0011] 本發(fā)明還設(shè)及一種檢測梅花參的方法，所述方法包括如下步驟：
[0012] (1)對待測樣本進行質(zhì)譜前處理，獲得待測多膚濾液：
[0013] (2)通過質(zhì)譜法檢驗待測樣本的多膚成分，分析樣本中的梅花參成分。
[0014] 所述的質(zhì)譜前處理步驟如下：
[001引 （1)稱取Ig海參樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，加入10血蛋白提取液（8M尿素，50mM畑4肥03)震蕩提取蛋白，高速低溫離屯、（20000r/min)，取上清液200ul轉(zhuǎn)移到1mlEP管中； [0016] (2)取2yLImol/LDTT(0. 154g二硫基蘇糖醇DTT溶于1血去離子水中）加入到 100yL上述蛋白溶液中37°C反應(yīng)1小時；
[0017]做取10iiL現(xiàn)配的lAA(準(zhǔn)確稱取0. 185g艦代乙酷胺lAA溶于1血去離子水中， 配置成Imol/L的IAA母液備用，配置過程需避光，現(xiàn)用現(xiàn)配）加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上 述反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)1小時；
[001引 （4)采用10K濾膜20000g超濾30分鐘，使用200yL50mmol/L碳酸氨錠溶液反復(fù) 沖洗濾膜上層3次后，轉(zhuǎn)移至新的EP管中；
[0019] (5)再加入200yL碳酸氨錠溶液重復(fù)此步驟，合并溶液完成膜下蛋白提取；
[0020] (6)取加1T巧psin酶溶液（1yg/yL的Trypsin酶溶液）加入到上述蛋白溶液 中37°C酶解16-18小時；
[0021] (7)采用10K濾膜14000g超濾20分鐘，收集下層的膚段濾液，待上機檢測。
[0022] 所述的質(zhì)譜法檢測為，采用ABSCIEXTripleTOF? 5600檢測，
[002引流動相A:0. 1 %甲酸-乙臘，流動相B:0. 1 %甲酸-水，
[0024]流速：0. 25血/min，
[00巧]T0F掃描范圍：350-1500Da，
[0026] 正離子反應(yīng)模式，GS1 :35,GS2 :45,CudainGas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP: 100,CE:10。
[0027] 所述的分析樣本中的梅花參成分為，將待測樣品的質(zhì)譜結(jié)果對比SEQIDNO. 1~4 的各條特異性多膚的質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)SEQIDNO. 1~4的各條特異性多膚的質(zhì)譜檢測譜圖 時，即可判斷該組織樣本為梅花參樣本。
【附圖說明】
[0028] 圖1，ADIAEDSLK在AB5600上膚段斷裂圖
[0029] 圖2,ADIAEDSLK在梅花參中的質(zhì)譜圖
[0030] 圖3,AGPAGDDAPR在AB5600上膚段斷裂圖
[0031] 圖4,AGPAGDDAPR在梅花參中的質(zhì)譜圖
[0032] 圖5,MPIPLLEGK在AB5600上膚段斷裂圖
[003引 圖6,MPIPLLEGK在梅花參中的質(zhì)譜圖
[0034] 圖7,LDIPLLEGK在AB5600上膚段斷裂圖 [003引 圖8,LDIPLLEGK在梅花參中的質(zhì)譜圖
【具體實施方式】
[0036] 實施例1，特異性多膚的序列來源和比對信息
[0037] 1.梅花參獨有的多膚ADIAEDSLK來源
[0038] 梅花參獨有的多膚ADIAEDSLK來自于蛋白tropomyosin[Apostichopus japoni州s]，其在NCBI上的Accesionnumber是giI302340969,序列如下沈QIDNO. 5 所 示，分析發(fā)現(xiàn)ADIAEESLK第6位Glu突變成了Asp,得到的多膚ADIAEDSLK經(jīng)過NCBIblast 比對，未發(fā)現(xiàn)與其他任何物種一致：
[0039] SEQIDNO. 5 ：
[0040] MDTIK邸LS化KAD邸KALD邸DVAEASMKEAMERVEQVNDEN邸LQTRIKQLETEL孤T沈KLNTTVI KCEAAEKAQQTAEEEMANLQ服LQLT邸化SRSEERVADLQSKYTDIEQS沈E肥RQ服VLESRSAA孤EM沈LET QVMSSKTSLEDSD服YDEAS服LTVT邸ELARS邸RSAAFES化SQMKEEL冊LHNNVKSLEA犯邸巧E肥EMYEK KV畑LEDKLKVAEDRADIAEESLKSLKTSLDQLEDELMIE邸KVREMTEEMERTI犯LN陽V
[00川采用ABSCIEX刊惦T彌15 5600質(zhì)譜儀（AB5600)檢測目標(biāo)膚段的斷裂圖和質(zhì)譜 圖
[0042] 圖1是ADIAEDSLK在AB5600上膚段斷裂圖 [004引 圖2是ADIAEDSLK在梅花參中的質(zhì)譜圖，
[0044] 其母離子為481. 245，
[0045] 子離子分別為：890. 447, 775. 420,662. 336 和 591. 298。
[0046] 2.梅花參獨有的多膚AGPAGDDAPR來源
[0047] 多膚AGPAG孤APR來自于蛋白actinisoform2 出olothuriagl油errima]，其 在NCBI上的Accesionnumber是gi|215882299,序列如下沈QIDNO. 6所不，分析發(fā)現(xiàn) AGFAGDDAPR第3位Phe突變成了Pro,得到的多膚AGPAGDDAPR,經(jīng)過NCBIblast比對，雖然 發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌、鼠類等物種和其一致，但對比刺參、海地瓜、美國肉參、墨西哥參，該多膚是梅 花參獨有的：
[0048] 沈QIDNO. 6 :
[0049] MCE邸VAALVVDNGSGMCKAGFAG孤APRAVFPSIVGRPR冊GVMVGMGQ邸SYVGDEAQSKRGILTLK YPIE服IVTNW孤MEKIWHHTFY肥LRVA陽邸PV化TEA化NPKANREKMTQIM陽TFNAPAMYVAIQA化化YAS GRTTGIVLDSGDGVTHTVPIYEGYALPHAIL化DLAG畑LTDYLMKILTERGYSFTTTAEREIV畑I邸KLCYVALD 陽犯MATAASSSSLEKSYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGmETTYNSIMKCDIDIRKDLYANSVL SGGTSMYPGIADRMQKEITALAPPTMKIKIIAP陽服YSVWIGGSILA化STFQQMWISK犯YDESGPSIVH服CF
[0050] 圖3是AGPAGDDAPR在AB5600上膚段斷裂圖
[0051] 圖4是AGPAGDDAPR在梅花參中的質(zhì)譜圖，
[0052] 其母離子為309. 482，
[0053] 子離子分別為：701. 321,630. 284,573. 263 和 428. 201。
[0054] 3.梅花參獨有的多膚MPIPLLEGK、LDIPLLEGK的來源
[00巧]多膚MPIPLLEGK和LDIPLLEGK均來自于蛋白majoryolkprotein2[Apostichopus j耶oni州s]，其在NCBI上的Accesionnumber是giI240846033,序列如下SEQIDNO. 7 所不， 分析發(fā)現(xiàn)MLIPLLEGK第2位Leu突變成了Pro,得到了多膚MPIPLLEGK;MLIPLLEGK第1位Met 突變成了Leu,第2位Leu突變成了Asp,得到了多膚LDIPLLEGK。運兩個多膚經(jīng)過NC