BIblast 比對，雖然發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌等物種和其一致，但對比刺參、海地瓜、美國肉參、墨西哥參，該兩條多 膚是梅花參獨有的：
[0056] SEQIDNO. 7 ：
[0057] MKY化LFCLAVGAFASINIEREGECPTD口NVDSTLYGVCNDECDVDSSCSDQLHKCCATNCGRRCVNP MRVTPVT邸邸NKTREEITEMLTTIL沈服DLI邸LDMYPPPLARFIMMKNRTDWRMCVTTPC化服CQRIAQTMT YKVTPRKEWFCQLATTTEQCLFWAERGWTDTVMARENKIFVAVDKFNVTSLAYEKNKNAPTEKKKVQN口LALTLT TS…ET即HLMG服VCSAGV…TSA門TPMCNLIY邸VMLATGDVVESSADWGKMCVPGILNKT抑K肥TYP邸LT TACHNLETEYTGIKGSLKCIKSGHGEVVFVDSKVVKELDERFAGVFKLVCEDQSLPLSQWEQTKCHLGYTPRPVLFL NPERNVTYKNELKEIILEAGKMKTPTVDLFNSSDYVCI邸AP邸LIFMDENTNLEFLEDPFSLPAV犯YMKVFNTCQ ALTPKPRAKICTTTPVQYQKCITMKKVFQTDffiLRNISWGCVLARTEMDCMRNVLNGTADLYSGDVKEIFTAGNDFQ LQPMMIQDE化RFQKSLFHNATVKSYTIAVMKKSKFWKKFGEDTKVVNIRNLTVCSPDIKSVPNFHLPIGHLLSNGV IPRIGSV陽SVSRFYKSVCLPGAAPVDWTWDSDLILG肥VNWGIPGLSFYNFTG抑WFIWNAPHTWTFYNMN服TPG TLKEFMKNRMLIPLLEGKLTVPEGFNPDT抑YSILDDVLSVEGLGDILNDIPDEI畑SLVDIRTKRVDRKEKFRELY 邸KTGDAFV化畑RRLGKLTLRG化ggSFgNM抓EWGI抑DVNAP化SSKSVGKGMTGGKVS化畑ILRGAATTA孤 NTVIGNLLKDYDSEYTVPVISRIFSKLLNERFETLDGLAKTLEILHRVPTMSSIRGTDYEWLKHPAVQSYLKIYAPR LIS即SDLYTS邸LAKTQFSRYLNPIWLSPTF邸化DVTKTHMTKLTEMCRGYGDRQGVGNS肥PFYG肥GALRCIE DT邸GDIAFIDTKNFAl'LSTTDYVMVTPLGIVQPINPESIMNGTFGTVPFPALMTAFNKTGSWRWNVTKA化lAQKK YPTNTSTDYTMYGVDSVFMPETKKMYPVPLNMQTHPTYLGS化TRAFEALIKPSTHDWWKERRHICSGESYTNVIEQ RNGTCKAIVKDVTCGGMPRPKVISVGTTENKKPVVVRMCSRPTSFVREMAEFRCDNGYGYLKPVMVPTTCSCVPCDE 巧YKPTWTTDIMWNTTEKNHIITE…ETMMKLWGNEEFWTNHTLNSNFEIGVVNVTAMKNETEKLGPLTVLKSVGSC EANWYGNGWNTEWFVNTSRPVCLGUPGLRRTLTAQR…TKLMP
[0058] 圖5是MPIPLLEGK在AB5600上膚段斷裂圖
[0059] 圖6是MPIPLLEGK在梅花參中的質(zhì)譜圖，
[0060] 其母離子為499. 291，
[0061] 子離子分別為：866. 535, 769. 482,656. 398 和 559. 345。
[0062] 圖7是LDIPLLEGK在AB5600上膚段斷裂圖
[0063] 圖8是LDIPLLEGK在梅花參中的質(zhì)譜圖，
[0064] 其母離子為499. 300，
[0065] 子離子分別為：884. 509,769. 482,656. 398 和 559. 345。
[0066] 實施例2,海參樣本處理及檢測步驟
[0067] 對待測海參樣本進(jìn)行分析的步驟包括 [006引（一）樣本前處理步驟：
[006引 （1)稱取Ig海參樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，加入10血蛋白提取液（8M尿素，50mM 畑4肥03)震蕩提取蛋白，高速低溫離屯、（20000r/min)，取上清液200ul轉(zhuǎn)移到1mlEP管中；
[0070] (2)取2yLImol/LDTT(0. 154g二硫基蘇糖醇DTT溶于1血去離子水中）加入到 100yL上述蛋白溶液中37°C反應(yīng)1小時；
[0071] 做取lOyL現(xiàn)配的IAA(準(zhǔn)確稱取0. 185g艦代乙酷胺IAA溶于1血去離子水中， 配置成Imol/L的IAA母液備用，配置過程需避光，現(xiàn)用現(xiàn)配）加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上 述反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)1小時；
[007引 （4)采用10K濾膜20000g超濾30分鐘，使用200yL50mmol/L碳酸氨錠溶液反復(fù) 沖洗濾膜上層3次后，轉(zhuǎn)移至新的EP管中；
[0073] (5)再加入200yL碳酸氨錠溶液重復(fù)此步驟，合并溶液完成膜下蛋白提??；
[0074] (6)取加1T巧psin酶溶液（1yg/yL的Trypsin酶溶液）加入到上述蛋白溶液 中37°C酶解16-18小時；
[007引 （7)采用10K濾膜14000g超濾20分鐘，收集下層的膚段濾液，待上機(jī)檢測。
[007引（二）上機(jī)檢測，
[0077]采用ABSCIEXTripleTOF? 5600 檢測，
[007引流動相A:0. 1 %甲酸-乙臘，流動相B:0. 1 %甲酸-水，
[0079]流速：0. 25血/min，
[0080] TOF掃描范圍：350-1500Da，
[0081] 正離子反應(yīng)模式，GSl:35,GS2 :45,CudainGas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP: 100,CE:10。
[0082] 檢測結(jié)果對比實施例1中的各條特異性多膚的質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)實施例1所述質(zhì)譜 檢測譜圖時，即可判斷該組織樣本為梅花參樣本。
[0083] 經(jīng)進(jìn)一步鑒定，所述膚段為梅花參專有膚段，在其他刺參、美國肉參等不同海參品 種種未見表達(dá)。
【主權(quán)項】
1. 一組用于單獨或任意組合檢測梅花參（Thelenotaananas)的多肽，所述的多肽的 序列為： SEQIDNO. 1：ADIAEDSLK； SEQIDNO. 2：AGPAGDDAPR； SEQIDNO. 3：MPIPLLEGK； SEQIDNO. 4 :LDIPLLEGK。2. -種檢測梅花參的方法，所述方法包括如下步驟： (1) 對待測樣本進(jìn)行質(zhì)譜前處理，獲得待測多肽濾液： (2) 通過質(zhì)譜法檢驗待測樣本的多肽成分，分析樣本中的梅花參成分。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜前處理步驟如下： (1) 稱取海參樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，加入蛋白提取液（8M尿素，50mMNH4HC03)震蕩提取 蛋白，高速低溫離心，取上清液轉(zhuǎn)移到EP管中； (2) 取DTT加入到上述蛋白溶液中，37°C反應(yīng)1小時； (3) 取現(xiàn)配的IAA加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)1小時； (4) 采用10K濾膜超濾30分鐘，使用碳酸氫銨溶液反復(fù)沖洗濾膜上層3次后，轉(zhuǎn)移至新 的EP管中； (5) 再加入碳酸氫銨溶液重復(fù)此步驟，合并溶液完成膜下蛋白提?。? (6) 取Trypsin酶溶液加入到上述蛋白溶液，中37°C酶解16-18小時； (7) 采用10K濾膜超濾20分鐘，收集下層的肽段濾液，待上機(jī)檢測。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜法檢測為，采用ABSCIEX TripleTOF? 5600 檢測， 流動相A:0. 1 %甲酸-乙腈，流動相B:0. 1 %甲酸-水， 流速：〇? 25mL/min， T0F掃描范圍：350-1500Da， 正離子反應(yīng)模式，GS1 :35,GS2 :45,CurtainGas:35,ISVF:5500,TEM:500,DP: 100，CE：10〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的分析樣本中的梅花參成分為， 將待測樣品的質(zhì)譜結(jié)果對比SEQIDNO. 1~4的各條特異性多肽的質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)SEQID NO. 1~4的各條特異性多肽的質(zhì)譜檢測譜圖時，即可判斷該組織樣本為梅花參樣本。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用專屬性肽段組鑒別梅花參(Thelenota？ananas)的方法，以及一組用于通過質(zhì)譜法鑒定梅花參的對照多肽，所述多肽的序列為：SEQ？ID？NO.1：ADIAEDSLK；SEQ？ID？NO.2：AGPAGDDAPR；SEQ？ID？NO.3：MPIPLLEGK；SEQ？ID？NO.4：LDIPLLEGK。經(jīng)鑒定:SEQ？ID？NO.1：ADIAEDSLK所述肽段為梅花參專有肽段，在其他物種中未見表達(dá)；SEQ？ID？NO.2：AGPAGDDAPR；SEQ？ID？NO.3：MPIPLLEGK；SEQ？ID？NO.4：LDIPLLEGK所述肽段雖在其他物種中存在，但在刺參、海地瓜、美國肉參、墨西哥參、美國肉參中未見表達(dá)，上述肽段為梅花參專有肽段。
【IPC分類】G01N27/62
【公開號】CN105116044
【申請?zhí)枴緾N201510501307
【發(fā)明人】李八方, 張鴻偉, 趙雪
【申請人】中國海洋大學(xué)
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月14日