基于IgY的檢測母牛早孕的膠體金試紙條的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的檢測診斷試劑盒的制備和應(yīng)用，具體設(shè)及一種基于 I巧的檢測診斷母牛早孕的膠體金試紙條的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孕酬（Progesterone'簡稱P4)是一種醬體類激素，主要由黃體及胎盤產(chǎn)生。母 畜體內(nèi)的孕酬（P4)主要在卵巢合成，是反映卵巢活動的精確指示劑（M址aAl-Asma化M Sc, 2007)，在控制母畜生殖活動的過程中發(fā)揮重要功能。
[0003] 母畜在妊娠期間體內(nèi)P4水平會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基礎(chǔ)水平，且會一直持續(xù)到分娩（Fatima Y化化etal.，1999 ;史遠(yuǎn)剛等，1996)。通過測定母畜體液（如尿液、血液、乳汁等）中的 P4水平及其含量變化，不但能夠了解母畜動物的生殖生理規(guī)律，而且還能夠監(jiān)測母畜生殖 系統(tǒng)疾?。煌瑫r，運(yùn)也是研究母畜生殖生理及生殖系統(tǒng)疾病的重要途經(jīng)，是預(yù)防和治療母畜 繁殖障礙性疾病的一種有效方法。測定母畜血液或者奶中的孕酬含量，還可W用于早孕診 斷、發(fā)情鑒定及不孕癥診斷（劉顯義等，1984);亦可用于母畜卵巢機(jī)能、繁殖疾病和產(chǎn)科疾 病的研究；同樣還可用于檢測人工授精效果、激素試驗(yàn)，并為遺傳分析提供了有效的生理指 標(biāo)等。早期妊娠診斷對于改善乳牛繁殖情況、減少空懷時間、縮短胎間距、提高乳牛飼養(yǎng)的 經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。
[0004] 卵黃抗體（eggyo化antibody,I巧）是通過對禽類（雞）免疫注射特定抗原，從 而在體內(nèi)產(chǎn)生I巧，經(jīng)血液由母體傳遞到卵黃內(nèi)，在卵黃中富集，進(jìn)而通過分離卵黃，獲得的 特異性多克隆抗體。相對于從哺乳動物血清中獲得抗體，避免了常規(guī)的動物采血，減輕了 動物的痛苦，同時通過卵黃獲得抗體，產(chǎn)量大，制備簡單，每枚蛋中可W提純50~lOOmg的 抗體，且母雞易于飼養(yǎng)，費(fèi)用低，便于大規(guī)模的生產(chǎn)特異性抗體，經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢明顯。與哺乳動 物免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)相似，I巧的F油片段包含抗原結(jié)合位點(diǎn)，化片 段包含的位點(diǎn)有補(bǔ)體激活功能、調(diào)理素作用和致敏過敏反應(yīng)作用等功能。但是其結(jié)構(gòu)同哺 乳動物有些不同，相對于IgG，I巧重鏈的氨基酸殘基數(shù)量多于IgG，且重鏈恒定區(qū)（CH區(qū)） 數(shù)量多于IgG，而輕鏈小于IgG。I巧理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使I巧相對于 IgG更適合用于治療制劑。I巧等電點(diǎn)（PI)在5. 7-7.6之間，在pH4. 0~11. 0時I巧穩(wěn) 定，比兔IgG對酸變性更為敏感，當(dāng)抑值從4降到3時，I巧活性迅速喪失，而IgG對此 只受到微小影響；I巧在低溫下儲存時性能較穩(wěn)定，室溫下可保持6個月的活性，4°C儲存 6~7 年活性下降僅 5%(JaradatZW,Marquar化RR. 2000.Sadiesonthest油ility ofchickenIgYindifferentsugars,complexcarbohydratesandfoodmaterials. FoodandAgricuhuralImmunology, 12(4) :263-272)(卵黃抗體IgY，在不同的糖，復(fù)合碳 水化合物和食品原料的的穩(wěn)定性研究。糧食和農(nóng)業(yè)免疫學(xué)雜志）；IgY抗胃蛋白酶消化的 穩(wěn)定性較牛IgG差，但抗膜蛋白酶和糜蛋白酶能力則較強(qiáng)（ShimizuM,化gashimaH，Sano K,etal. 1992.MolecularstabilityofchickenandrabbitimmunoglobulinG.Biosci BiotechnolBiochem，56(2) : 270-274)(雞和兔免疫球蛋白IgG的分子穩(wěn)定）。由于系統(tǒng)發(fā) 生學(xué)距離造成哺乳動物和雞抗體特異性的差異，相對于哺乳動物IgG，I巧應(yīng)用于檢測也具 有多方面的優(yōu)勢如：1巧與風(fēng)濕因子、人類抗鼠抗體（HAM)沒有交叉反應(yīng)，無補(bǔ)體系統(tǒng)活性 和異質(zhì)性凝集素，且不結(jié)合蛋白A和蛋白G，可W避免交叉反應(yīng)。此外，禽類針對保守性強(qiáng) 的蛋白質(zhì)往往能引發(fā)較哺乳動物抗體更強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，成為有關(guān)抗體研發(fā)的重要選擇因 素。 陽〇化]免疫膠體金技術(shù)是80年代繼=大標(biāo)記技術(shù)（巧光素、放射性同位素和酶）后發(fā)展 起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。最初該方法僅用于免疫電鏡技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到電鏡技 術(shù)、光鏡染色、免疫印跡、免疫斑點(diǎn)滲濾法及免疫層析技術(shù)等。膠體金標(biāo)記實(shí)質(zhì)上是蛋白等 高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，其吸附機(jī)理可能是利用它在堿性條件下帶負(fù) 電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷集團(tuán)，靠近電吸引而牢固結(jié)合，因而金標(biāo)一抗或二抗有 較好的穩(wěn)定性。用于免疫測定時，膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，運(yùn)類膠體 金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡稱免疫金。目前醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用的免疫膠體金快速診 斷技術(shù)有兩種：膠體金快速免疫層析法和快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法。都是W微孔濾膜為載體， 包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原 或抗體與膜上包被的抗體或抗原相結(jié)合，再用膠體金結(jié)合物標(biāo)記而顯色來達(dá)到檢測目的。
[0006] 免疫層析技術(shù)是在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易、快速的免疫學(xué)監(jiān)測技 術(shù)。具有W下優(yōu)點(diǎn)：(1)快速迅捷，大大縮短出結(jié)果時間，運(yùn)是目前其他快速檢測方法所無法 達(dá)到的。運(yùn)種快速與膠體金本身顯色特點(diǎn)有關(guān)，也與免疫層析法的免疫濃縮有關(guān)。似靈敏準(zhǔn) 確，結(jié)果受外因影響較少。而結(jié)合銀染時，檢測的敏感性更大大提高。此外，由于膠體金標(biāo) 記蛋白質(zhì)是一物理結(jié)合過程，結(jié)合牢固，很少引起蛋白質(zhì)活性改變，所W試劑非常穩(wěn)定，不 受溫度等外界因素影響，可在辦公室、家中甚至野外進(jìn)行檢測，試驗(yàn)結(jié)果也可長期保存。樹 安全簡便，不需任何儀器和設(shè)備。只需制備好的試紙條即可；可通過制備單克隆抗體或基因 工程抗體，將待側(cè)抗原的抗體包被于試紙條，直接檢測組織或體液中的抗原。（4)成本低廉， 所需試劑和樣本量少。因?yàn)槊庖邼饪s，免疫層析法所需試劑和樣本量都非常少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，膠體金的敏感性可達(dá)到化ISA水平膠體金還有很高的動力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不 被破壞時，自身凝聚極慢，可放置數(shù)年。目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷，尤其是在醫(yī)學(xué)臨床檢 驗(yàn)中的應(yīng)用，如：早孕、乙肝、性病、寄生蟲及病毒細(xì)菌病的檢測，還有激素的測試，如市場上 銷售的金標(biāo)hCG快速檢測試紙條。在免疫層析法用于HCG快速檢測的研究中，有試驗(yàn)表明： 采用膠體金免疫層析分析方法檢測靈敏度可達(dá)50IIV1，與高含量的LH、FSH、T甜均無交叉 反應(yīng)，檢測214例臨床樣品，準(zhǔn)確率為100%。而動物醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的應(yīng)有起步很晚，尤 其是在激素的檢測方面。國內(nèi)奶牛孕酬快速免疫檢測試劑盒的開發(fā)應(yīng)用還很少。但據(jù)其優(yōu) 點(diǎn)、原理、及廣泛的應(yīng)用前景，將運(yùn)項(xiàng)技術(shù)貢獻(xiàn)于奶孕酬的測定將是一個很好的嘗試。鹽酸 克隆特羅，與孕酬同樣是一種小分子物質(zhì)，目前已有研究表明膠體金標(biāo)記鹽酸克隆特羅單 克隆抗體可W制備膠體金試紙條。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在于提供一種基于I巧檢測診斷母牛 早孕的膠體金試紙條的制備方法。
[0008] 技術(shù)方案：基于I巧的檢測診斷母牛早孕的膠體金試紙條的制備方法，包括W下 步驟：
[0009] (1)孕酬半抗原及偶聯(lián)物的合成，其中，偶聯(lián)物包括孕酬和牛血清白蛋白偶聯(lián)物， 孕酬和卵清白蛋白偶聯(lián)物W及孕酬與過氧化氨偶聯(lián)物；
[0010] (2)W白蛋白和步驟（1)得到的偶聯(lián)物做抗原免疫適齡雞，制備含抗體的免疫蛋， 通過免疫蛋提取特異性I巧，并將牛血清白蛋白與孕酬的偶聯(lián)形成孕酬全抗原，將孕酬全抗 原作為檢測原監(jiān)測I巧的特異性；
[0011] (3)膠體金試紙條的制備，
[0012] 制備膠體金溶液，并用該膠體金溶液標(biāo)記純化好的步驟（2)中的特異性I巧；再將 膠體金標(biāo)記好的抗體吸附于玻璃纖維墊上，冷凍干燥待用；將山羊抗雞的抗體和孕酬全抗 原固定于硝酸纖維素膜上并封閉；最后組裝膠體金試紙條。
[0013] 作為本發(fā)明中基于I巧的檢測診斷母牛早孕的膠體金試紙條的制備方法的一種 優(yōu)選方案：步驟（1)包括W下步驟
[0014] (11)孕酬半抗原的合成 陽01引（111)在628mg孕酬中加入400uL化咯燒與12mL甲醇，在室溫水浴中攬拌5min;
[0016](112)再加入300uL化咯燒和219mg簇甲氧基胺半鹽酸鹽，加熱到50~60°C， 保持此溫度反應(yīng)化；
[0017] (113)將溶劑真空干燥，再溶于15mL蒸饋水中形成溶液，向溶液中滴加Imol/L 的肥1水溶液調(diào)節(jié)抑到2,出現(xiàn)白色沉淀，過濾，得到白色沉淀； 陽〇1引（114)用15血乙酸乙酷溶解步驟（113)得到的白色沉淀，再用等體積的4wt% 化OH水溶液萃取6次合并水層；
[0019] (115)用冰浴冷卻，調(diào)抑到3. 0,然后用乙酸乙酷萃?。?br>[0020] m巧水洗有機(jī)層至中性，加入Na2S〇4脫水，真空干燥，得到網(wǎng)格狀的黃色晶體即 為孕酬半抗原；
[0021] (12)偶聯(lián)物合成： 陽02引（121)稱取40mg步驟（116)得到的孕酬半抗原溶于1血無水DMF,加入20uLS正 下胺，冰浴攬拌下加入了 0.8ml氯甲酸異下醋的DMF溶液，氯甲酸異下醋的DMF溶液中氯 甲酸異下醋與DMF的體積比為1:40, 4°C下攬拌比，升至室溫反應(yīng)比得到蛋白質(zhì)溶液；
[0023] (122)各稱取40mgBSA、0VA分別溶解于8血的棚酸鹽緩沖液中形成反應(yīng)液，棚酸 鹽緩沖液的pH為8. 7,棚酸鹽緩沖液的濃度為0. 05mol/l;