[0024] (12如將步驟（12。得到的反應(yīng)液均分為兩份逐滴滴加到步驟（121)得到的蛋白 質(zhì)溶液中，15°C下攬拌過(guò)夜，次日，將反應(yīng)液置于透析袋中，在4°C下于0.Olmol/1的憐 酸緩沖溶液中透析5天，每化換1次透析液，將透析袋中的偶聯(lián)物小量分裝后于-20°C保 存。
[0025] 作為本發(fā)明中基于I巧的檢測(cè)診斷母牛早孕的膠體金試紙條的制備方法的一種 優(yōu)選方案：步驟（2)包括W下步驟： 陽(yáng)〇%] (21)、向16周齡雞進(jìn)行初次免疫注射，免疫劑量為300 y g ;
[0027](22)、初次免疫后25天進(jìn)行二次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0028](23)、二次免疫后14天進(jìn)行=次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0029](24)、S次免疫后14天進(jìn)行四次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0030](25)、四次免疫后14天進(jìn)行五次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0031](26)、收集免疫注射的雞所生的雞蛋提取特異性I巧；
[0032] (261)將收集的雞蛋進(jìn)行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將10ml卵黃使用20ml的 PBS進(jìn)行稀釋得到稀釋液； 陽(yáng)03引（26。向步驟（1)中得到的稀釋液加入適量陽(yáng)G-6000,充分?jǐn)埌?~10分鐘，置 于搖床上室溫?fù)u晃30分鐘得到混合液，混合液中PEG-6000的質(zhì)量體積比為3. 5%;
[0034] (263)將步驟（262)得到的混合液離屯、，收集上清，過(guò)濾，濾液加入適量陽(yáng)G-6000， 充分?jǐn)埌?~10分鐘，置于搖床上室溫?fù)u晃30分鐘得到混合液，混合液中PEG-6000的質(zhì) 量體積比為8. 5% ;
[0035] (264)將步驟（263)得到的混合液離心棄去上清液，沉淀使用10ml的PBS懸浮， 加入適量陽(yáng)G-6000,充分?jǐn)埌?~10分鐘，置于搖床上室溫?fù)u晃30分鐘得到混合液，混合 液中PEG-6000的質(zhì)量體積比為12%，再將混合液離屯、，獲得沉淀物；
[0036] (265)將步驟（264)得到的沉淀物使用2ml的PBS溶解后，使用透析袋進(jìn)行透析， 使用PBS透析3次，獲得的特異性I巧。
[0037] 作為本發(fā)明中基于I巧的檢測(cè)診斷母牛早孕的膠體金試紙條的制備方法的一種 優(yōu)選方案：步驟（3)包括W下步驟：
[0038] (31)膠體金的制備：
[0039] (311)取30mL超純水在50mLS角瓶中，加Iwt%氯金酸0.6血混勻，加熱煮沸；
[0040] (3。）取Iwt%梓樣酸S鋼溶液0. 9mL，快速加入煮沸的氯金酸溶液中，待溶液變 為紫紅色后煮沸2~3分鐘后得到膠體金溶液；
[0041] (313)冷卻后，將膠體金溶液用0.45um微孔濾器過(guò)濾得到濾液即為膠體金；
[0042] (32)膠體金一抗孕酬多克隆抗體結(jié)合物的制備：
[0043] (321)用蒸饋水按照體積比1:800稀釋步驟（265)得到的特異性I巧，再后取 lOOuL稀釋后的特異性I巧加入到ImL膠體金溶液中，反應(yīng)5min后加入0.ImL質(zhì)量體積比 為10%化C1水溶液，混勻后靜置2小時(shí)得到抗體； 柳44] (32。取20血膠體金溶液于離屯、管中，攬拌，用0. 2mol/L的K2CO3水溶液調(diào)整PH 值到7.4,用侶銷紙包住離屯、管，避光條件下，劇烈攬拌，迅速加入0.0075ug步驟（321)得到 的抗體，然后繼續(xù)攬拌2分鐘，并在室溫條件下解育20分鐘；同樣在攬拌條件下，逐滴加入 卵清白蛋白和陽(yáng)G-20000，使卵清白蛋白和陽(yáng)G-20000的終濃度分別為0. %及0.Iwt%， 繼續(xù)攬拌，反應(yīng)20分鐘，4°C放置2~3小時(shí)后，在4°C條件下10000轉(zhuǎn)/分，離屯、20min，離 屯、后取出離屯、管，觀察沉淀物的狀態(tài)初步確定標(biāo)記效果，用真空累抽離上清，留200微升上 清，得到膠體金一一抗孕酬多克隆抗體結(jié)合物； W45] (3如膠體金標(biāo)記抗體玻璃纖維的制備：
[0046] (331)將制備好的膠體金-抗孕酬多克隆抗體結(jié)合物原液ImU用水1:4的稀釋成 使用濃度，混勻；
[0047] (332)把玻璃纖維膜剪成2. 4cmx8cm/條；
[0048] (333)將一條剪好的玻璃纖維膜放在平坦干凈的玻璃板上，取1. 4血膠體金-抗 孕酬多克隆抗體稀釋液，均勻地加在玻璃纖維膜上，使玻璃纖維膜浸透，然后置37°C烤 干，置4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0049] (34)將山羊抗雞的抗體和孕酬全抗原固定于硝酸纖維素膜上并封閉
[0050] (341)分別將山羊抗雞IgG與孕酬全抗原用點(diǎn)樣機(jī)W區(qū)帶狀劃在硝酸纖維素膜 上，室溫下自然干燥，加入0. 01M抑為7. 4的PBS緩沖液配制的含有5%脫脂奶粉的封閉 液，4°C作用4~5小時(shí)或37度2小時(shí)，點(diǎn)樣時(shí)山羊抗雞IgG濃度為l-3mg/Ml，點(diǎn)樣量為1 微升；孕酬全抗原偶聯(lián)濃度為1. 5mg/ml，點(diǎn)樣量為0. 5微升；
[0051] (342)用水沖洗干凈，； 陽(yáng)05引（3似）用Tris-肥L緩沖液洗膜3次，室溫驚干，密封備用；
[0053] (35)組裝膠體金試紙條
[0054]W吸附有膠體金標(biāo)記的孕酬抗體的玻璃纖維墊為加樣區(qū)，W包被有山羊抗雞的 IgG和孕酬全抗原的硝酸纖維素膜作為質(zhì)控檢測(cè)區(qū)，W雙層吸水紙為吸附區(qū)，依次按加樣 區(qū)、質(zhì)控檢測(cè)區(qū)、吸附區(qū)的順序貼于雙面膠聚乙締板表面，制成試紙條。
[0055] 有益效果：本發(fā)明公開(kāi)的基于I巧的檢測(cè)診斷母牛早孕的膠體金試紙條的制備方 法具有W下有益效果：
[0056] 本發(fā)明是在結(jié)合抗原抗體的免疫學(xué)反應(yīng)和層析原理的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的，增強(qiáng)了檢測(cè) 孕酬的特異性和靈敏度，顯著的縮短了檢測(cè)時(shí)間和減低了檢測(cè)下限，攜帶方便，操作簡(jiǎn)單， 成本低廉，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0057] 圖1為抗孕酬I巧效價(jià)監(jiān)測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0058] 下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】詳細(xì)說(shuō)明。
[0059] 具體實(shí)施例1
[0060] 基于I巧的檢測(cè)診斷母牛早孕的膠體金試紙條的制備方法，包括W下步驟：
[0061] (1)孕酬半抗原及偶聯(lián)物的合成，其中，偶聯(lián)物包括孕酬和牛血清白蛋白偶聯(lián)物， 孕酬和卵清白蛋白偶聯(lián)物W及孕酬與過(guò)氧化氨偶聯(lián)物；
[0062] (2)W白蛋白和步驟（1)得到的偶聯(lián)物做抗原免疫適齡雞，制備含抗體的免疫蛋， 通過(guò)免疫蛋提取特異性I巧，并將牛血清白蛋白與孕酬的偶聯(lián)形成孕酬全抗原，將孕酬全抗 原作為檢測(cè)原監(jiān)測(cè)I巧的特異性；
[0063] (3)膠體金試紙條的制備，
[0064] 制備膠體金溶液，并用該膠體金溶液標(biāo)記純化好的步驟（2)中的特異性I巧；再將 膠體金標(biāo)記好的抗體吸附于玻璃纖維墊上，冷凍干燥待用；將山羊抗雞的抗體和孕酬全抗 原固定于硝酸纖維素膜上并封閉；最后組裝膠體金試紙條。 W65] 進(jìn)一步地，步驟（1)包括W下步驟
[0066](11)孕酬半抗原的合成
[0067] (111)在628mg孕酬中加入400uL化咯燒與12mL甲醇，在室溫水浴中攬拌5min; W側(cè)（1。）再加入300uL化咯燒和219mg簇甲氧基胺半鹽酸鹽，加熱到50°C，保持此 溫度反應(yīng)化； W例 （11如將溶劑真空干燥，再溶于15mL蒸饋水中形成溶液，向溶液中滴加Imol/L 的肥1水溶液調(diào)節(jié)抑到2,出現(xiàn)白色沉淀，過(guò)濾，得到白色沉淀；
[0070] (114)用15血乙酸乙酷溶解步驟（113)得到的白色沉淀，再用等體積的4wt% 化OH水溶液萃取6次合并水層； W71] (1巧）用冰浴冷卻，調(diào)抑到3. 0,然后用乙酸乙酷萃?。?陽(yáng)0巧 m巧水洗有機(jī)層至中性，加入Na2S〇4脫水，真空干燥，得到網(wǎng)格狀的黃色晶體即 為孕酬半抗原； 陽(yáng)〇7引（。）偶聯(lián)物合成：
[0074] (121)稱取40mg步驟（116)得到的孕酬半抗原溶于1血無(wú)水DMF,加入20uLS正 下胺，冰浴攬拌下加入了 0. 8ml氯甲酸異下醋的DMF溶液，氯甲酸異下醋的DMF溶液中氯 甲酸異下醋與DMF的體積比為1:40, 4°C下攬拌比，升至室溫反應(yīng)比得到蛋白質(zhì)溶液； 陽(yáng)07引 （12。各稱取40mgBSA、0VA分別溶解于8血的棚酸鹽緩沖液中形成反應(yīng)液，棚酸 鹽緩沖液的pH為8. 7,棚酸鹽緩沖液的濃度為0. 05mol/l;
[0076] (12如將步驟（12。得到的反應(yīng)液均分為兩份逐滴滴加到步驟（121)得到的蛋白 質(zhì)溶液中，15°C下攬拌過(guò)夜，次日，將反應(yīng)液置于透析袋中，在4°C下于0.Olmol/1的憐 酸緩沖溶液中透析5天，每化換1次透析液，將透析袋中的偶聯(lián)物小量分裝后于-20°C保 存。
[0077] 進(jìn)一步地，步驟似包括W下步驟：
[0078](21)、向16周齡雞進(jìn)行初次免疫注射，免疫劑量為300 y g ;
[0079](22)、初次免疫后25天進(jìn)行二次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0080](23)、二次免疫后14天進(jìn)行=次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0081] (24)、S次免疫后14天進(jìn)行四次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0082](25)、四次免疫后14天進(jìn)行五次免疫，免疫劑量為250 y g ;
[0083](26)、收集免疫注射的雞所生的雞蛋提取特異性I巧；