多層熒光納米顆粒及其制備和使用方法
【專利說明】多層熒光納米顆粒及其制備和使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年2月20日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/767, 066的優(yōu)先權(quán)， 其公開的內(nèi)容通過引用并入本申請(qǐng)。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦政府咨助研究的聲明
[0004] 本發(fā)明在由美國國土安全部提供的合同號(hào)為2009-ST-108-LR0004的政府支持下 進(jìn)行。政府享有本發(fā)明的一些權(quán)益。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本公開通常地涉及分層的含熒光響應(yīng)材料的納米顆粒。更特別地，本公開涉及多 層的含熒光響應(yīng)材料的二氧化硅納米顆粒。
【背景技術(shù)】
[0006] 藥物發(fā)現(xiàn)、藥物篩選、基因表達(dá)和作為疫苗靶點(diǎn)的蛋白鑒定基于進(jìn)行涉及大量分 子的高通量篩選（HTS)測(cè)定。這需要篩選針對(duì)特定靶分子（如蛋白、抗體、核苷酸或肽）的 較大的化合物庫。篩選較大的庫或生物多重測(cè)定（biological multiplexing)加速了用于 治療和診斷應(yīng)用的工具的開發(fā)。生物多重測(cè)定涉及同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)測(cè)定，而不損失敏感性和 特異性。推行小型化的HTS導(dǎo)致每天篩選數(shù)以千計(jì)的化合物。從上到下的二維陣列制造技 術(shù)導(dǎo)致了 DNA芯片、微陣列和bioMEMS的發(fā)展?；谀Ｊ阶R(shí)別的位置編碼進(jìn)一步有助于鑒 定特定的分子指紋。這些技術(shù)的一些主要缺點(diǎn)是它們就設(shè)備設(shè)置和試劑而言是昂貴的，且 就樣品制備和陣列制造而言是復(fù)雜的。而且，由于交叉反應(yīng)性和重現(xiàn)性所導(dǎo)致的測(cè)量的變 化性使得這些方法難以用于大規(guī)模分析。
[0007] 此前已對(duì)使用基于顏色分配的珠粒技術(shù)進(jìn)行多重編碼的可能性進(jìn)行了探索。使用 兩種有機(jī)染料在用于多重測(cè)定的8種不同的強(qiáng)度水平下對(duì)5. 5 μπι聚苯乙烯珠粒編碼。通 過在適宜溶劑混合物中溶脹聚合物，合成了在6種不同的強(qiáng)度水平下以不同比例使用6種 光譜可區(qū)分的CdSe/ZnS核-殼量子點(diǎn)納米顆粒編碼的1. 2 μ m聚苯乙稀珠粒。在上述情況 中的熒光物質(zhì)均被物理地?fù)饺胛⒚壮叽绲木郾揭蚁╊w粒，并且由于其具有較大的尺寸，因 而無法容易地用于體內(nèi)多重或細(xì)胞內(nèi)生物成像。基于可用反應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)量，通過使用不同 比例的兩種有機(jī)熒光團(tuán)精確地標(biāo)記DL-DNA，開發(fā)了基于樹枝狀大分子樣DNA (DL-DNA)的熒 光納米條碼。為了增強(qiáng)來自這些納米條碼的熒光信號(hào)，再次使用微珠作為成像和分子檢測(cè) 的載體。類似地，合成以不同染料比例將染料編碼的70nm的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET) 的二氧化硅納米顆粒，并將其負(fù)載于10 μm的鏈霉親和素涂覆的微球上。通過開發(fā)以不同 染料比例將染料編碼的>l〇〇nm的基于（FRET)的二氧化硅顆粒（隨后將所述二氧化硅顆粒 負(fù)載于作為多重測(cè)定底物的10 μπι聚苯乙烯微球上），將這項(xiàng)工作推廣并應(yīng)用于在組合化 學(xué)中的光學(xué)編碼?；诩尤敕磻?yīng)混合物中的染料并假定摻入所有的染料，從而量化在這些 基于FRET的顆粒中編碼的染料比例。由于最終珠粒的較大的尺寸（>1 μπι)，這些情況均未 顯示出細(xì)胞內(nèi)成像。
[0008] 因而，需要制備多重編碼的顆粒，其中FRET被抑制以獲得所需水平的顆粒亮度， 并且因此獲得所需的信噪比，所述顆粒的尺寸為約IOOnm或更小，并且由于尺寸低于IOOnm 的顆粒特別適用于細(xì)胞攝取，因此所述顆粒能夠用于體內(nèi)和體外應(yīng)用，并且因此是細(xì)胞內(nèi) 成像應(yīng)用所需的。
[0009] 發(fā)明概沐
[0010] 本文公開了具有任選的表面PEG涂層（用于使用不同的部分（如蛋白、核酸、小 分子）官能化）的多色熒光二氧化硅納米顆粒（在本文中也稱為多層的含熒光響應(yīng)材料 (FRM)的納米顆粒、mcC點(diǎn)和三色C點(diǎn)以及多色C點(diǎn)）。可以將多色熒光二氧化硅納米顆粒 稱為亮多色熒光二氧化硅納米顆粒。例如，含有在兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)不同強(qiáng)度水平下的兩 種、三種或更多種光譜不同的染料的納米顆粒具有低于IOOnm的尺寸。所述多色熒光二氧 化硅納米顆粒可以用于例如細(xì)胞內(nèi)生物成像、高通量篩選和醫(yī)學(xué)診斷。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述二氧化硅納米顆粒含有染料N- (7-二甲基氨基-4-甲基 香豆素-3-基）馬來酰亞胺（DACm(藍(lán)色））、四甲基羅丹明-5-馬來酰亞胺（TMRm(綠色）） 和Cy5-馬來酰亞胺（Cy5m(紅色））。這些染料以每種染料三個(gè)強(qiáng)度水平（無染料、低染料 或高染料）而被包含。對(duì)顆粒構(gòu)造進(jìn)行設(shè)計(jì)，以控制每種顏色的染料數(shù)量，并且使得染料之 間的能量轉(zhuǎn)移最小化以獲得最大亮度。三種染料在三個(gè)強(qiáng)度水平的這種組合使得基于波長 和熒光強(qiáng)度合成了 26種可區(qū)分的顆粒。與游離染料相比，所述納米顆粒具有1至3個(gè)數(shù)量 級(jí)的熒光亮度增強(qiáng)。具有高染料負(fù)載的納米顆粒的亮度是具有中等染料負(fù)載的顆粒的~ 3. 5-4倍。在該體系中，通過摻入額外的二氧化硅殼由中等染料負(fù)載移至高染料負(fù)載不會(huì)減 少所述納米顆粒的相對(duì)熒光發(fā)射。
[0012] 進(jìn)行制備多色熒光二氧化硅納米顆粒的方法，使得例如染料以逐層的方式加入摻 雜染料的顆粒的核，并且每種光譜不同的染料由純的二氧化硅殼空間分隔，以降低染料之 間的能量轉(zhuǎn)移。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方式中，合成所述納米顆粒，使得三種染料以逐層的方式加入，其中綠 色在核中，然后是在內(nèi)殼中的紅色，然后藍(lán)色作為最后的染料層加入。但是，在不影響所述 納米顆粒性能的情況下，可以進(jìn)行任意順序的染料加入。染料層由足夠厚的二氧化硅殼空 間分隔，以有效抑制染料層之間的能量轉(zhuǎn)移。因此，每個(gè)單獨(dú)的顆粒均具有洋蔥型結(jié)構(gòu)，所 述洋蔥型結(jié)構(gòu)具有例如在染料核周圍的多達(dá)24個(gè)不同的層。
[0014] 附圖簡(jiǎn)沐
[0015] 圖I : (a)將三種染料TMRm (綠色）、Cy5m(紅色）和DACm (藍(lán)色）摻入二氧化硅 納米顆粒（中心）的逐層方法以及基于每種染料的包封水平（分別為〇、5、20個(gè)染料）的 可能組合的示意圖。簡(jiǎn)言之，具有中等染料負(fù)載（~5個(gè)染料/顆粒，淺色）和高染料負(fù)載 (~20個(gè)染料/顆粒，深色）的顆粒以淺色/深色的綠色、紅色和藍(lán)色顯示。（b)拍攝的在 水中的26個(gè)合成的核-殼多色熒光納米顆粒的照片，所述26個(gè)合成的核-殼多色熒光納 米顆粒以不同的行排列為無TMRm的顆粒（無綠色，下面一行）、具有~5TMRm的顆粒（較低 的綠色染料負(fù)載，中間一行）和在核中的具有~20TMRm染料的顆粒（高的綠色染料負(fù)載， 上面一行）。注意最下面一行（左側(cè)）的第27個(gè)比色皿顯示了無任何染料（即具有顏色組 合〇,〇,〇)的純二氧化硅顆粒的溶液。（c)圖Ib中顯示的納米顆粒的要點(diǎn)。空白表示作為 對(duì)照的無任何染料的純二氧化硅顆粒。TMRm(綠色）、Cy5m(紅色）和DACm(藍(lán)色）。
[0016] 圖2 :多色C點(diǎn)（mcC點(diǎn)）合成的示意圖：(a)對(duì)具有不同的每個(gè)顆粒的平均染料 數(shù)的合成批次的泊松分布之間的重疊進(jìn)行比較的圖，參見圖例。曲線的順序從左至右為：5、 10、15、20個(gè)染料/顆粒。（b)三種染料TMRm(I)、Cy5m (2)和DACm (3)的馬來酰亞胺衍生物 與（3-巰基丙基）-三甲氧基硅烷反應(yīng)以獲得分別的染料-硅烷綴合物的通用反應(yīng)示意圖。 (c-e)單色C點(diǎn)的逐層染料添加：TMRm顆粒（G)、Cy5m顆粒（R)和DACm顆粒（B)，隨后加入 5k摩爾質(zhì)量的聚乙二醇硅烷（PEG-硅烷）作為最后的層；（f-h)由G和R單色C點(diǎn)起始的 具有不同亮度水平的雙色mcC點(diǎn)（(f)為G和R組合、（g)為G和B組合，且（h)為R和B 組合）的逐層方法，隨后使用PEG-硅烷封端；和（i)由含有雙色C點(diǎn)的G和R起始的使用 PEG-硅烷封端的三色C點(diǎn)的逐層方法。
[0017] 圖3 :單色C點(diǎn)的表征。圖（a-c)對(duì)中等和高染料負(fù)載的納米顆粒與（a)TMRm、（b) Cy5m和（c)DACm的母體游離染料的吸光度和熒光光譜進(jìn)行比較。游離染料的溶液和顆粒 的溶液在這些測(cè)量之前是吸光度匹配的。圖（d-f)對(duì)在溶液中的游離染料（實(shí)線）的FCS 自相關(guān)曲線與中等（空心圈）和高（實(shí)心圈）染料負(fù)載的納米顆粒：(d)TMRm、（e)Cy5m和 (f)DACm的FCS自相關(guān)曲線進(jìn)行比較。圖（g-i)對(duì)（g)TMRm體系、（h)Cy5m體系和（i)DACm 體系的如由FCS檢測(cè)器數(shù)據(jù)集測(cè)得的每種熒光物質(zhì)的亮度（染料vs顆粒）進(jìn)行比較。
[0018] 圖4 :mcC點(diǎn)的表征。（a)在溶液中的獲得三色C點(diǎn)的特定顆粒中間體的代表性FCS 曲線，其覆蓋了從中等/高TMRm染料負(fù)載的單色C點(diǎn)（mG，綠色空心圈/hG，綠色實(shí)心圈） 起始，經(jīng)由中等/高Cy5m染料負(fù)載的雙色C點(diǎn)（hGmR，紅色空心圈/hGhR，紅色實(shí)心圈），至 具有中等/高DACm染料負(fù)載的最終三色C點(diǎn)（hGhRmB，藍(lán)色空心圈/hGhRhB，藍(lán)色實(shí)心圈） 的整個(gè)合成路線。藍(lán)色（左側(cè)曲線）、綠色（中間曲線）、紅色（右側(cè)曲線）。（b)由藍(lán)色 (左）、綠色（中）和紅色（右）激發(fā)獲得的三色C點(diǎn)的代表性熒光發(fā)射光譜。（c)由穩(wěn)態(tài) 熒光發(fā)射光譜測(cè)定的26個(gè)熒光二氧化硅納米顆粒中的每一個(gè)的實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度性質(zhì)的總結(jié)。綠 色柱表示來自TMRm的發(fā)射、紅色柱表示來自Cy5m的發(fā)射，藍(lán)色柱表示來自DACm的發(fā)射。柱 的高度表示發(fā)射強(qiáng)度水平。
[0019] 圖5 :顯示通道的在RBL-2H3肥大細(xì)胞中的mcC點(diǎn)的共聚焦熒光顯微圖像，（a)綠 色 Ch :560nm，（b)紅色 Ch :633nm，（c)藍(lán)色 Ch :405nm，（d)黃色 Ch :488nm ; (e) (a、b、c 和 d)的重疊圖像，（f)亮場(chǎng)圖像。
[0020] 圖6 :顯示含有至多17種不同顆粒的細(xì)胞的單一 512x 512混合顆粒圖像圖塊。 (a-d)圖像在紅色、綠色、藍(lán)色和黃色通道同時(shí)采集。（e)疊加全部四個(gè)熒光圖像以顯示顆 粒實(shí)際上在細(xì)胞內(nèi)。（f)在亮場(chǎng)采集的圖像。
[0021] 圖7 :將17種光譜不同的多色納米顆粒裝載進(jìn)入大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞中。（a) 顯示多顆粒樣品成功"解碼"的細(xì)胞的全尺寸（1280x 1280像素）假彩色圖像，所述細(xì)胞各 自負(fù)載17種單"色"me C點(diǎn)中的1種。說明顆粒組成和所指定的細(xì)胞顏色的顏色-編碼圖 例在右下角顯示。（b)相同圖像的放大區(qū)。
[0022] 發(fā)明詳沐
[0023] 本公開提供了多層的含熒光響應(yīng)材料（FRM)的納米顆粒。還提供了制備和使用所 述多層的含F(xiàn)RM的納米顆粒的方法。
[0024] 本公開的多層的含F(xiàn)RM的納米顆粒提供了能夠通過特定的FRM及FRM水平而唯一 識(shí)別的納米顆粒。具有用于識(shí)別的內(nèi)置碼的納米顆粒能夠作為分子運(yùn)載體和標(biāo)簽。特定的 FHM/水平組合（可以將其描述為光學(xué)"條碼"）能夠通過其熒光發(fā)射（例如以圖像的形式） 識(shí)別。例如，在具有不同F(xiàn)HM/水平組合的多層的含F(xiàn)RM的納米顆粒的混合物中，每個(gè)不同 的FHM/水平組合能夠得以唯一識(shí)別。每個(gè)可區(qū)分的顆粒類似于2-D陣列技術(shù)中的單一孔 或陣列。因此多重測(cè)定不受孔或陣列數(shù)量的限制，但是受可區(qū)分的顆粒的數(shù)量的限制。納 米顆粒的構(gòu)造使層內(nèi)和層間FRM的熒光淬滅最小化。這通過有效使用顆粒中的所有熒光染 料而提供了具有所需的亮度的納米顆粒，從而在光學(xué)/熒光檢測(cè)方案中產(chǎn)生所需的信躁比 水平。
[0025] 在一個(gè)方面，本公開提供了多層的含F(xiàn)RM的二氧化硅納米顆粒。所述納米顆粒包 含能夠以一種或多種量（即水平）存在的一種或多種熒光響應(yīng)材料（FRM)。所述納米顆粒 的尺寸（例如直徑）可以是5nm至500nm，包括其間所有的整數(shù)值和范圍。
[0026] 本文提及多層的含F(xiàn)RM的納米顆粒旨在包括多層的含染料的納米顆粒。本申請(qǐng)中 提及的無FRM的二氧化硅層旨在包括無染料的二氧化硅層。本文提及含F(xiàn)RM的二氧化硅層 旨在包括含有染料的二氧化硅層。本文提及最外的無FRM的二氧化硅層旨在包括最外的含 染料的二氧化硅層。本文提及FRM旨在包括染料分子。本文提及FRM-綴合物前體旨在包 括染料-綴合物前體。本文提及最外的含F(xiàn)RM的二氧化硅層旨在包括最外的含染料的二氧 化娃層。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含二氧化硅核、1至100個(gè)含F(xiàn)RM的二氧化硅 層、一個(gè)或多個(gè)無FRM的二氧化娃層、設(shè)置于最外的含F(xiàn)RM的二氧化娃層上的最外的無FRM 的二氧化硅層，和與所述最外的無FRM的二氧化硅層的外表面共價(jià)結(jié)合的多個(gè)聚（乙二醇） 分子；所述二氧化硅核含有與所述核的二氧化硅網(wǎng)絡(luò)共價(jià)結(jié)合的多個(gè)FRM分子，每個(gè)含F(xiàn)RM 的二氧化硅層均包含與所述含F(xiàn)RM的二氧化硅層的二氧化硅網(wǎng)絡(luò)共價(jià)結(jié)合的多個(gè)FRM分 子，所述無FRM的二氧化硅層之一將所述二氧化硅核與所述含F(xiàn)RM的二氧化硅層之一分隔， 并且，如果存在，所述含F(xiàn)RM的二氧化硅層的每個(gè)相鄰對(duì)被所述無FRM的二氧化硅層之一所 分隔。所述納米顆粒還可以包含與共價(jià)結(jié)合至所述最外的無FRM的二氧化硅層的外表面的 所述聚（乙二醇）分子共價(jià)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)部分（例如蛋白、肽、核酸、適體、抗體、抗體 片段、聚合物、有機(jī)小分子及其組合）。所述納米顆粒能夠具有的直徑為5nm至500nm，包括 其間所有的整數(shù)nm值和范圍。每個(gè)無FRM的二氧化娃層的厚度（例如Inm至20nm)使得 在所述核中的FRM與在一個(gè)相鄰的含F(xiàn)RM的二氧化硅層或多個(gè)相鄰的含F(xiàn)RM的二氧化硅層 中的FRM之間具有低于10 %的可檢測(cè)的能量轉(zhuǎn)移。
[0028] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含二氧化硅核、1至100個(gè)含F(xiàn)RM的二氧化 娃層、一個(gè)或多個(gè)無FRM的二氧化娃層，和設(shè)置于最外的含F(xiàn)RM的二氧化娃層上的最外的無 FRM的二氧化硅層；所述二氧化硅核含有與所述核的二氧化硅網(wǎng)絡(luò)共價(jià)結(jié)合的多個(gè)FRM分 子，每個(gè)所述含F(xiàn)RM的二氧化硅層均包含與所述含F(xiàn)RM的二氧化硅層的二氧化硅網(wǎng)絡(luò)共價(jià) 結(jié)合的多個(gè)FRM分子，所述無FRM的二氧化硅層之一將所述二氧化硅核與所述含F(xiàn)RM的二 氧化硅層之一分隔，并且，如果存在，所述含F(xiàn)RM的二氧化硅層的每個(gè)相鄰對(duì)被所述無FRM 的二氧化硅層之一所分隔。所述納米顆粒能夠具有的直徑為5nm至500nm，包括其間所有的 整數(shù)nm值和范圍。每個(gè)無FRM的二氧化娃層的厚度（例如Inm至20nm)使得在所述核中 的FRM與在一個(gè)相鄰的含F(xiàn)RM的二氧化硅層或多個(gè)相鄰的含F(xiàn)RM的二氧化硅層中的FRM之 間具有低于10%的可檢測(cè)的能量轉(zhuǎn)移。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)無FRM的二氧化硅層可以設(shè)置于二氧化硅核或含F(xiàn)RM的 二氧化硅層上。
[0030] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米顆粒包含a)二氧化硅核，所述二氧化硅核含有與 所述核的二氧化硅網(wǎng)絡(luò)共價(jià)結(jié)合的多個(gè)FRM ;和b)圍繞所述二氧化硅核的無FRM的二氧化 硅層與含F(xiàn)RM的層的交替的層。最外層是無FRM的二氧化硅層或含F(xiàn)RM的層。任選地，多 個(gè)聚醚分子共價(jià)結(jié)合最外的無FRM的二氧化硅層或含F(xiàn)RM的層的外表面。
[0031] 所述核的形狀基本上是球形，并且其尺寸（例如直徑）可以為Inm至20nm，包括其 間的所有整數(shù)nm值。所述核具有能夠與所述核的氧化硅網(wǎng)絡(luò)共價(jià)結(jié)合的多個(gè)熒光響應(yīng)材 料（例如焚光響應(yīng)分子，如染料分子和顏料分子）。
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