化硅殼的合成。以30 分鐘每毫升反應(yīng)體積2 μ 1的速率向I. 3. c部分中提及的IOml mGmR、mGhR、hGmR和hGhR中 加入I. 8M的純TE0S，以獲得6-8nm厚的殼。將含TMRm和Cy5m的雙色顆粒中的每一個(gè)的 IOml溶液加入分別的圓底燒瓶中。DI水和氨在乙醇中的濃度分別保持在0. 88M和0. 2M。
[0103] 將DACm染料綴合物加入負(fù)載TMRm和Cy5m的雙色顆粒中。對(duì)于中等DACm負(fù)載 而言，將5 X 10 5M DACm染料綴合物加入含IOml mGmR、mGhR、hGmR和hGhR顆粒溶液的反應(yīng) 燒瓶的每一個(gè)中并攪拌8小時(shí)。通過以每30分鐘每毫升反應(yīng)體積1 μ 1的速率滴加0. 15M 的純TEOS，將薄二氧化硅殼加入反應(yīng)以形成二氧化硅殼。留出5ml反應(yīng)溶液作為mGmRmB、 mGhRmB、h GmRmR 和 h Gh RmR 顆粒。
[0104] 對(duì)于高DACm負(fù)載而言，將5ml乙醇加入5ml的含中等DACm負(fù)載顆粒的三色顆粒 溶液中。DI水和氨在乙醇中的濃度分別保持在0. 88M和0. 2M。將9X 10 5M DACm染料綴 合物加入IOml反應(yīng)溶液并攪拌8小時(shí)，隨后以每30分鐘每毫升反應(yīng)體積1 μ 1的速率加入 0. 15Μ的純TE0S。將溶液攪拌4小時(shí)，隨后是進(jìn)一步的DACm染料層-TEOS二氧化硅殼添加。 該交替的DACm染料綴合物-TEOS殼添加順序進(jìn)行三次，以獲得高DACm負(fù)載顆粒：mGmRhB、 mGhRhB、hGmRhB 和 hGhRhB 顆粒。
[0105] 在PEG化之前在納米顆粒上的二氧化硅殼生長(zhǎng)。通過滴加TEOS而在所有顆粒上 生長(zhǎng)二氧化硅殼，以對(duì)于所有納米顆粒獲得相同的尺寸。對(duì)于所有溶液而言，DI水和氨在 乙醇中的濃度分別保持在0. 88M和0. 2M。
[0106] 向IOml含中等（I. Lb部分）/高（I. Lc部分）DACm顆粒的溶液中加入4. 8M TE0S，并且向中等/高TMRm顆粒（I. 3. a部分）中以每30分鐘每毫升反應(yīng)體積2 μ 1的速 率加入2. 7Μ TE0S。向5ml中等和高Cy5m顆粒溶液（I. 3. b部分）中以每30分鐘每毫升反 應(yīng)體積2 μ 1的速率加入3. 6M TEOS。
[0107] 向5ml含G-R (I. 3. c部分）/G-B (I. 3. d部分）/R-B (I. 3. e部分）的雙色顆粒溶液 中分別以每30分鐘每毫升反應(yīng)體積2 μ 1的速率加入2. 6M TE0S/2. 6M TE0S/3. 3M TE0S。
[0108] 向5ml僅含中等DACm顆粒（I. 3. f部分）的三色顆粒溶液中，以30分鐘每毫升反 應(yīng)體積2 μ 1的速率加入另外0. 7M TE0S。不向含高DACm的三色顆粒中加入另外的TE0S。
[0109] mcC 點(diǎn)納米顆粒的 PEG 化。使用 pH 計(jì)（VWR International Symphony, SB70P)通 過加入2. OM鹽酸（aq.)將I. 0升DI水調(diào)整至pH 5。為了進(jìn)行PEG化，如顆粒合成部分所 述將所有顆粒生長(zhǎng)至相同的尺寸。通過將PEG-硅烷溶于pH 5的DI水中，制備0. 08M的 PEG-硅烷（mPEG-硅烷，M.W. 5k)水溶液。取出Iml該溶液至小瓶中，加入2ml乙醇并將該 溶液攪拌約10分鐘。將1.0 ml的制備得到的顆粒溶液滴加至3ml的溶于乙醇-水混合物 中的mPEG-硅烷中，然后在保持在70°C的油浴中將該溶液攪拌24小時(shí)。
[0110] 在PEG化后，使用10, OOOMffCO透析膜管在DI水中透析顆粒，并使用0· 2 μ m PTFE 注射式濾器過濾顆粒，并在室溫下避光保存顆粒以用于進(jìn)一步表征。
[0111] 對(duì)于細(xì)胞成像測(cè)量而言，使用 MffCO 為 30, 000 的 Macroscp3i Advance Centrifugal Device將顆粒轉(zhuǎn)移至Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS)中。透析后，將5ml PEG化的納米 顆粒溶液加入5ml緩沖溶液中，并在3500rpm下離心30分鐘。使用緩沖溶液將該過程重復(fù) 三次。作為最后一步，將顆粒加熱至75°C達(dá)15分鐘以將溶液巴氏殺菌，隨后加入0. 1% (w/ v)的疊氮化鈉水溶液。
[0112] 中等和高染料負(fù)載的納米顆粒的表征。27個(gè)比色皿的反射光圖像的照片在環(huán)境光 下拍攝。照片圖像排列為在核中無TMRm染料的顆粒（下面一行）、在核中具有~5個(gè)TMRm 染料的顆粒（中間一行）和在核中具有~20個(gè)染料的顆粒（上面一行）。每行均使用固定 在三角架上的佳能EOS數(shù)字Rebel 400D相機(jī)在ISO 100以及f/4. 5下的二次曝光為l/20th的相同設(shè)置下獨(dú)立拍攝，然后使用Adobe Photoshop以所述的排列疊放。
[0113] 光譜測(cè)定和熒光光譜測(cè)定。使用Varian Cary 5000分光光度計(jì)（Varian，Palo Alto, CA)，通過在石英比色皿中用DI水稀釋顆?；蛴坞x染料，從而將顆粒與分別 的游離染料進(jìn)行吸光度匹配。使用DACm (25, OOOM 1Cm ^、TMRm (98, OOOM 1Cm 3和 Cy5m(250, 000M 1Cm 3的消光系數(shù)對(duì)樣品中染料的濃度進(jìn)行定量。在Photon Technologies International Quantamaster焚光光譜儀（PTI, Birmingham, NJ)上進(jìn)行吸光度匹配的樣 品的熒光測(cè)量。
[0114] 熒光相關(guān)光譜（FCS)。為了對(duì)各顆粒的亮度、顆粒的流體力學(xué)半徑和濃度進(jìn)行定 量；在使用固態(tài)405nm(用于DACm顆粒）、HeNe 535nm(用于TMRm顆粒）和HeNe 633nm(用 于Cy5m顆粒）激光激發(fā)源的自制的多光譜熒光相關(guān)光譜（FCS)裝置上測(cè)量吸光度匹配的 樣品。激發(fā)束通過60X Olympus UPlan SAP0,1. 2NA水浸物鏡反射。使用1. 5號(hào)蓋玻片底部 (1&1?4?356-1.5-10-〇將200以1^體積納摩濃度的熒光樣品置于微孔皿上。來自樣品的 發(fā)射光通過物鏡收集，經(jīng)過激發(fā)/發(fā)射分色鏡并由發(fā)射鏡反射至聚焦透鏡中。發(fā)射光通過 長(zhǎng)通濾波器（Chroma)聚焦，以除去任意的激發(fā)光并且僅收集發(fā)射光子。使用50微米針孔軸 向限制收集熒光的有效體積。然后光通過第二透鏡進(jìn)入雪崩光電二極管（SPCM 14, Perkin Elmer)。將所得到的光電流與相關(guān)器卡（Correlator, com)數(shù)字自相關(guān)。
[0115] 使用三重校正自相關(guān)函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，如等式1中的分析形式所示。
[0117] 等式 1
[0118] A是三重校正的振幅，τ R是三重態(tài)的染料分子/顆粒的表觀擴(kuò)散時(shí)間，τ D是單重 態(tài)的分子/顆粒的擴(kuò)散時(shí)間，且N是在聚焦體積中的分子數(shù)量。結(jié)構(gòu)因子參數(shù)'s'描述了 就軸向與徑向軸比率而言的3-D高斯聚焦體積，并且由具有已知擴(kuò)散系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)染料的測(cè) 量計(jì)算得到。為了獲得405nm、535nm和633nm激光線的結(jié)構(gòu)因子's'，使用的染料分別為 N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基）-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明-5-馬來酰亞胺和 Alexa Fluor647_馬來酰亞胺。
[0119] 細(xì)胞成像。細(xì)胞培養(yǎng)。如此前所述，RBL-2H3細(xì)胞在補(bǔ)充有20% FBS(Atlanta Biologicals)和10 μ g/ml硫酸慶大霉素的MEM中保持單層培養(yǎng)。
[0120] 經(jīng)由電穿孔將納米顆粒遞送進(jìn)入細(xì)胞。傳遞后3-5天收集細(xì)胞，并將IXlOfVml RBL-2H3細(xì)胞在具有懸浮于DPBS緩沖液中的200 μ 1納米顆粒（5-10 μ M)的0. 5ml的冷的 電穿孔緩沖液（137mM NaCl、2.7mM KClUmM MgCl2、lmg/ml 葡萄糖和 20mM HEPES(pH 7.4)) 中電穿孔。使用方波電穿孔，其使用Gene Pulser X (Bio-Rad)，并具有280V、10.0 ms脈沖 長(zhǎng)度、4次脈沖和0.1 ms的脈沖間隔的設(shè)置。對(duì)于26種納米顆粒中的每一種重復(fù)該程序。 在使用4%多聚甲醛和0. 1%戊二醛固定前，使經(jīng)電穿孔的細(xì)胞恢復(fù)約1小時(shí)。然后在室溫 下使用〇. 5 μ g/ml Alexa 488霍亂毒素亞基B標(biāo)記經(jīng)固定的細(xì)胞達(dá)15分鐘，以將細(xì)胞膜染 色。
[0121] 共聚焦成像。含有納米顆粒的細(xì)胞在使用40X水物鏡（N. A = 1. 2)的蔡斯510LSM 共聚焦顯微鏡上進(jìn)行成像。依次使用用于激發(fā)的405、488、561、63311!11激光線和用于收集發(fā) 射光的420-480 (帶通，BP)、575 (長(zhǎng)通，LP)、505-550 (BP)和650 (LP)濾光片組，從而拍攝圖 像。使用ImageJ將圖像分成綠色、紅色、藍(lán)色、黃色和亮場(chǎng)圖像。在ImageJ中連接重疊圖 像，所述重疊圖像僅含有來自四個(gè)發(fā)射通道的圖像。基于紅色、綠色和藍(lán)色圖像的共定位而 鑒定顆粒。
[0122] 在進(jìn)行任何光譜測(cè)量之前，使用5k摩爾質(zhì)量的聚（乙二醇）-硅烷將所有得到的 顆粒PEG化（見實(shí)驗(yàn)部分）。由于對(duì)全部26種顆粒物質(zhì)完整光譜表征的描述超出了本文的 范圍，因此這里僅提供了特定mcC點(diǎn)的代表性示例，以及對(duì)在全部26種顆粒中的所有顏色 的亮度水平的光譜測(cè)量的概述，參見圖3和4。為了表征納米顆粒并了解其熒光性質(zhì)，將中 等和高DACm、TMRm和Cy5m染料負(fù)載的單色納米顆粒的第一水溶液與其各自的母體游離染 料的第一水溶液進(jìn)行吸光度匹配。圖3a-c顯示了所得到的吸光度和發(fā)射光譜。未觀察到 游離染料和顆粒之間明顯的光譜位移，這表明通過包封而保存了染料的電子結(jié)構(gòu)。相對(duì)于 游離染料，摻雜中等和高DACm、TMRm和Cy5m染料的納米顆粒分別顯示~6. 0、~1. 3和~ 1.5的增強(qiáng)。對(duì)于全部三種體系而言，將染料包封至剛性二氧化硅環(huán)境中因此導(dǎo)致與在水溶 液中的游離染料相比顯著的亮度增強(qiáng)，這與此前的研究一致，并且表明在這些條件下，即使 在本文所述的高負(fù)載水平下，染料也未顯示出熒光淬滅。
[0123] 使用熒光相關(guān)光譜（FCS)結(jié)合吸光度測(cè)量對(duì)摻入顆粒中的染料數(shù)量進(jìn)行定量。 FCS的實(shí)驗(yàn)裝置配置為分別在λ = 405nm、543nm和633nm下激發(fā)染料（參見實(shí)驗(yàn)部分）。 FCS是基于擴(kuò)散的熒光技術(shù)，其使用擴(kuò)散部分的熒光以產(chǎn)生自相關(guān)曲線。與動(dòng)態(tài)光散射 (DLS)類似，相關(guān)衰減的時(shí)間標(biāo)度可與擴(kuò)散系數(shù)相關(guān)，而擴(kuò)散系數(shù)反過來又可以與擴(kuò)散部分 的流體力學(xué)半徑/直徑相關(guān)。圖3d-f對(duì)三種母體染料（實(shí)線）得自相關(guān)曲線與分別衍生 自中等和高染料負(fù)載的三種染料/顏色的6種單色C點(diǎn)（mG、mR和mB，空心符號(hào)；hG、hR和 hB，實(shí)心符號(hào)）的自相關(guān)曲線進(jìn)行了比較。與母體游離染料相比，摻入染料的納米顆粒擴(kuò)散 更慢，這確證了由游離染料到顆粒的流體力學(xué)半徑的顯著增加。而且，含有中等和高染料水 平的顆粒顯示出非常類似的相關(guān)曲線，這揭示了對(duì)最終目標(biāo)顆粒尺寸的高度控制。對(duì)DACm、 TMRm和Cy5m體系的自相關(guān)曲線的分析揭示了游離染料的分別為I. 3nm、I. 4nm和I. 4nm的 直徑，以及中等和高染料負(fù)載納米顆粒的分別為40nm、45nm和35nm的直徑。
[0124] 由FCS自相關(guān)曲線的振幅G(O)，能夠獲得在聚焦體積中的熒光部分的數(shù)量，由所 述數(shù)量能夠推斷出其濃度。使用該顆粒濃度以及由吸光度測(cè)量獲得的染料濃度，能夠計(jì)算 出每個(gè)顆粒的染料數(shù)量。這是能夠?qū)υ诙嗌獵點(diǎn)（mcC點(diǎn)）的合成中每個(gè)顆粒的染料數(shù)量 進(jìn)行定量評(píng)估的一條信息，所述信息用作優(yōu)化合成方案的反饋以達(dá)到本文所述的必要的控 制水平。基于這些測(cè)量，我們計(jì)算了中等和高染料負(fù)載的顆粒的每個(gè)顆粒的染料數(shù)量對(duì) 于TMRm、Cy5m和DACm染料負(fù)載分別為6/27、6/22和6/24。而且，由包封在顆粒中的染料 與在水溶液中的游離染料相比的熒光增強(qiáng)與每個(gè)顆粒的染料數(shù)量的乘積，可以計(jì)算每個(gè)染 料-顆粒體系的亮度因子。該因子描述了相對(duì)于水溶液中的單一游離染料，顆粒更亮多 少。以這種方式確定的分別的亮度因子為：中等/高TMRm顆粒9. 1/35、中等/高Cy5m顆 粒9/33,和中等/高DACm顆粒36/144。這些結(jié)果表明，顆粒應(yīng)比母體游離染料亮1至2個(gè) 數(shù)量級(jí)。除了其多重測(cè)定性質(zhì)以外，這些非常高的亮度水平將使得mcC點(diǎn)在生物成像應(yīng)用 方面極具吸引力。計(jì)算亮度因子與通過在光學(xué)FCS檢測(cè)器上單獨(dú)的擴(kuò)散物質(zhì)的計(jì)數(shù)率所測(cè) 定的染料和顆粒的實(shí)驗(yàn)亮度是可以相比較的。這分別提供了游離染料和顆粒的亮度的直接 量度。圖3g-i顯示了這些測(cè)量的結(jié)果。圖3g顯示中等/高TMRm負(fù)載顆粒的亮度是母體 TMRm游離染料的亮度的6. 6 (±0. 1) /32 (±0. 4)倍，而對(duì)于Cy5m體系而言，圖3h顯示了中 等/高Cy5m負(fù)載的顆粒的亮度是母體Cy5m游離染料的亮度的5. 3 (±0. 2)/27. 6 (±0. 4) 倍。圖3i比較了 DACm顆粒體系的亮度，并顯示中等/高DACm負(fù)載顆粒的亮度分別是母體 DACm游離染料的亮度的24 (±3. 0)/105 (±10)倍。這些直接的亮度測(cè)量確證了如目標(biāo)那 樣，各亮度水平彼此之間相差4-6倍。與在早期研究中的類似觀察一致，計(jì)算亮度因子系統(tǒng) 性地高估了獲自FCS測(cè)量的值。這可能是由于在染料當(dāng)量測(cè)定中的誤差所致，其例如在游 離染料和包封染料之間不呈現(xiàn)吸收截面的變化。其可能還是由于FCS檢測(cè)使用偏振光進(jìn)行 所致，所述偏振光可能僅激發(fā)顆粒中染料的子集，這反過來會(huì)導(dǎo)致每個(gè)顆粒的計(jì)數(shù)比從亮 度因子預(yù)期更小。
[0125] 此前的尺寸>3 μπι的熒光多殼納米顆粒的工作揭示了由于折射率的改變（其導(dǎo) 致發(fā)射光的散射），顆粒的熒光強(qiáng)度隨著殼層數(shù)量的增加而降低。我們通過比較中等和高 染料負(fù)載顆粒的每個(gè)顆粒染料數(shù)量與每個(gè)顆粒亮度的比率，從而檢驗(yàn)了相同的效應(yīng)是否適 用于本顆粒。我們的結(jié)果顯示，對(duì)于中等和高DACm負(fù)載顆粒而言，比率為4. 0/4. 3,對(duì)于 中等和高TMRm負(fù)載顆粒而言，比率為4. 5/4. 8,對(duì)于中等和高Cy5m負(fù)載顆粒而言，比率為 3. 66/3. 69。這些結(jié)果揭示，相比于此前的結(jié)果，在我們的系統(tǒng)中通過摻入另外的二氧化硅 殼從中等染料負(fù)載變化至高染料負(fù)載不會(huì)降低相對(duì)熒光發(fā)射。
[0126] 圖4a顯示了獲得三色C點(diǎn)的特定顆粒的代表性FCS曲線，其覆蓋了從中等/高 TMRm染料負(fù)載的單色C點(diǎn)（mG，空心圈/hG，實(shí)心圈）起始，經(jīng)由中等/高Cy5m染料負(fù)載的 雙色C點(diǎn)（hGmR，空心圈/hGhR，實(shí)心圈），至具有中等/高DACm染料負(fù)載的最終三色mcC 點(diǎn)（hGhRmB，空心圈/hGhRhB，實(shí)心圈）的整個(gè)合成路線。使用PEG化步驟終止該圖中的所 有顆粒，盡管顆粒沒有生長(zhǎng)至~85nm的相同尺寸。結(jié)果清楚地表明，從中等TMRm染料負(fù) 載顆粒開始至含有高染料負(fù)載的全部三種染料的顆粒，顆粒尺寸增加，如由移動(dòng)至更長(zhǎng)時(shí) 間的相關(guān)曲線所反映。綠色熒光顆粒的FCS曲線顯示了在短時(shí)間來自三重態(tài)的顯著貢獻(xiàn)， 這通過擬合程序解釋（參見實(shí)驗(yàn)部分）。中等TMRm負(fù)載的核殼顆粒合成