免疫彩色二氧化硅微球的制備方法、彩色試紙及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種新型免疫彩色二氧化硅微球的制備方法及應(yīng)用該新型免疫彩色二氧化硅微球制備的彩色快速檢測(cè)試紙和該試紙的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫層析法因具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果清晰等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床快速診斷領(lǐng)域的熱點(diǎn)。現(xiàn)有的試紙檢測(cè)產(chǎn)品主要是在膠體金免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上制成的膠體金免疫層析試紙等系列產(chǎn)品，該試紙條操作簡(jiǎn)單，陽(yáng)性結(jié)果能顯示清晰的紅色，是目前最主要的免疫層析產(chǎn)品；另一種是在乳膠凝集基礎(chǔ)上出現(xiàn)的彩色乳膠層析診斷試紙條，該試紙條可以用不同顏色的乳膠顆粒替代膠體金，使檢測(cè)結(jié)果除了顯示紅色外也可以顯示別的顏色。
[0003]而膠體金免疫層析試紙主要存在的缺陷有:
(I)膠體金顯色單一，通常只能顯示單一的紅色，其檢測(cè)結(jié)果無(wú)論何種樣本顯色的顏色都一樣，不能根據(jù)不同的品質(zhì)或要求改變顏色，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)一根試紙條對(duì)多種檢測(cè)物一次性同時(shí)檢測(cè)。(2)膠體金粒徑控制不易，很難依據(jù)試紙的需要調(diào)整粒徑的大小。(3)膠體金標(biāo)記過(guò)程有用到強(qiáng)還原劑，對(duì)人體健康有一定影響。(4)膠體金表面沒(méi)有生物活性基團(tuán)，其生物活性較差。(5)膠體金粒徑較小時(shí)是圓形，粒徑較大時(shí)為橢圓形，形狀不穩(wěn)定。
[0004]乳膠免疫層析試紙的缺陷有:
(O乳膠顆粒形狀往往不規(guī)則，大小難以控制。(2)乳膠微粒的粒徑較大，不利于微球在免疫層析試紙運(yùn)動(dòng)，試紙中的微球粒徑往往在40nm左右時(shí)運(yùn)動(dòng)和顯色效果最佳。(3)乳膠微球的顯色是通過(guò)把染料包裹在乳膠顆粒中，染料在微球里面使得顏色不夠艷麗，往往造成染料的泄露，使顯色效果變差，因此乳膠免疫層析試紙因顏色不夠清晰很難做到多種顏色的判別，不利于對(duì)多樣本的同時(shí)檢測(cè)。(4)乳膠微球因自身較為脆弱，容易受到各種理化因素的影響而出現(xiàn)自凝現(xiàn)象，最終造成結(jié)果的誤判，對(duì)檢測(cè)造成干擾。(5)乳膠微球與抗體的結(jié)合能力及敏感度不高。
[0005]因此，乳膠層析試紙條雖然能使檢測(cè)結(jié)果顯示不同的顏色，但顯色效果差，不同顏色的區(qū)分度不明顯，且乳膠顆粒與抗體的結(jié)合能力差，再加上自身的自凝現(xiàn)象，很容易出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的誤判，且難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多樣本的同時(shí)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)選擇、改進(jìn)和優(yōu)化制備條件，研制出生物相容性好、色彩鮮明、色澤穩(wěn)定的新型彩色免疫微球，開發(fā)一種更加直觀靈敏、簡(jiǎn)便穩(wěn)定的多功能新型彩色免疫檢測(cè)試紙產(chǎn)品及制備方法，實(shí)現(xiàn)不僅可以檢測(cè)單一樣本而且可以通過(guò)顯示不同的顏色實(shí)現(xiàn)一根試紙條一次性對(duì)多種樣本同時(shí)檢測(cè)的目的。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供一種新型免疫彩色二氧化硅微球的制備方法，包括以下步驟:
步驟a，將單分散彩色二氧化硅微球均勻分散在無(wú)水乙醇中，然后加入硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，進(jìn)行反應(yīng)；
步驟b，反應(yīng)后用無(wú)水乙醇清洗后再用超純水清洗，得到氨基化的彩色二氧化硅微球；步驟C，將氨基化的彩色二氧化硅微球放入離心管，用0.1MPBS緩沖液清洗后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的戊二醛溶液，振蕩攪拌，再用0.1M PBS緩沖液清洗，得到戊二醛化的修飾有醛基的彩色二氧化硅微球；
步驟d，以0.1M的PBS溶液為偶聯(lián)緩沖液，先用PBS緩沖液洗滌步驟c得到的微球，震蕩均勻后分散到0.1M的PBS溶液中，并加入抗體進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后清洗，再加入甘氨酸，混合反應(yīng)；用緩沖液清洗后得到新型免疫彩色二氧化硅微球。
[0008]進(jìn)一步，步驟a中，彩色二氧化娃微球的制備方法包括以下步驟:以triton-100為表面活性劑，正己醇為助表面活性劑，己烷為有機(jī)溶劑，混合振蕩至澄清，加入一定量水為分散相，形成微乳液，然后向微乳液中加入正硅酸乙酯，水解縮合形成微球，在反應(yīng)過(guò)程中加入氨水為催化劑，同時(shí)加入染料對(duì)微球進(jìn)行染色形成彩色二氧化硅微球，加入硅烷偶聯(lián)劑在微球表面引入氨基，形成單分散彩色二氧化硅微球。
[0009]進(jìn)一步，步驟a中反應(yīng)時(shí)間為4h。
[0010]進(jìn)一步，步驟a中每克單分散彩色二氧化硅微球分散于10mL的無(wú)水乙醇中。硅烷偶聯(lián)劑APTES的加入量為單分散彩色二氧化硅微球質(zhì)量的5%。
[0011]進(jìn)一步，步驟b中，用無(wú)水乙醇清洗三次后再用超純水清洗三次。
[0012]進(jìn)一步，步驟c中，振蕩攪拌2h。
[0013]進(jìn)一步，步驟d中，加入抗體反應(yīng)時(shí)間為4h，再加入甘氨酸，混合反應(yīng)15分鐘。
[0014]本發(fā)明還提供一種新型彩色快速檢測(cè)試紙，所述試紙上吸附有至少一種前述新型免疫彩色二氧化硅微球。
[0015]進(jìn)一步，所述不同顏色的二氧化硅微球上標(biāo)記有不同抗體。
[0016]本發(fā)明還提供一種新型彩色快速檢測(cè)試紙的制備方法，將特異性抗原或抗體以條帶狀固定在試紙?jiān)O(shè)定位置上，標(biāo)記有抗體或者單克隆抗體的新型彩色免疫二氧化硅微球吸附在結(jié)合墊上。
[0017]本發(fā)明的新型彩色檢測(cè)試紙可以有效診斷早孕的人絨毛促性腺激素(hCG)、檢測(cè)排卵的促黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)等，而且通過(guò)顯色條帶的控制亦可實(shí)現(xiàn)對(duì)異位妊娠的檢測(cè)，還可對(duì)尿液中的嗎啡、可卡因、海洛因、大麻、苯丙胺等多種毒品實(shí)現(xiàn)一次性同時(shí)檢測(cè)。另外，該新型彩色檢測(cè)試紙對(duì)其它傳染病的快速診斷同樣適用，包括各種病毒的相應(yīng)抗原及抗體，如各種病毒性肝炎、風(fēng)疹病毒抗體、腎綜合癥出血抗體、各種流感病毒的相應(yīng)抗原及抗體、登革熱病毒抗體及輪狀病毒菌等；性病，如艾滋病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、淋球菌及泌尿生殖系統(tǒng)的衣原體等；細(xì)菌類，如結(jié)核桿菌抗體、沙門菌等；寄生蟲，如瘧原蟲、血吸蟲抗體、弓形蟲抗體等；對(duì)腫瘤，包括對(duì)腫瘤進(jìn)行篩查和早期診斷有意義的腫瘤標(biāo)志物、心血管病、自家免疫病，食品安全包括食源性致病，農(nóng)獸藥殘留，違禁添加劑，生物毒素及食品中重金屬離子的快速檢測(cè)，及環(huán)境污染、生物制劑的快速檢測(cè)、獸醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)等方面都具有較好的應(yīng)用前景。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
用該方法制備的新型彩色免疫二氧化硅微球克服了傳統(tǒng)的彩色二氧化硅微球產(chǎn)量低，粒徑難以控制，分散性差，顯色效果不好，免疫效果不理想等缺點(diǎn)，同時(shí)也克服了膠體金顯色單一及乳膠微球粒徑不規(guī)則、顯色效果差，與蛋白結(jié)合不理想等缺點(diǎn)，通過(guò)選擇、改進(jìn)和優(yōu)化制備條件，制備的新型彩色免疫二氧化硅微球粒徑大小可控、不溶脹、穩(wěn)定耐儲(chǔ)、不自凝、表面光滑、形狀規(guī)則、生物相容性好、色彩鮮明、色澤穩(wěn)定、并能制成多種顏色的新型彩色免疫微球，是制備彩色檢測(cè)試紙條理想的新材料。
[0019]使用本發(fā)明的新型彩色免疫二氧化硅微球制備的新型彩色檢測(cè)試紙更加直觀、靈敏、經(jīng)濟(jì)準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，且該產(chǎn)品不僅可以檢測(cè)單一樣本而且可以通過(guò)顯示不同的顏色實(shí)現(xiàn)一根試紙條一次性對(duì)多種樣本同時(shí)檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0021]實(shí)施例1
單分散新型彩色二氧化硅微球的制備
將2 mL Triton-100、0.6 mL正己醇、2 mL己燒分別作為表面活性劑、助表面活性劑和有機(jī)溶劑，混合振蕩至澄清，加入一定量的水作為分散相，形成透明且穩(wěn)定的微乳液，再將ImL TEOS加入到微乳液反應(yīng)體系中作為反應(yīng)前提。為促進(jìn)TEOS更快的水解縮合反應(yīng)形成微球，在反應(yīng)過(guò)程中加入一定量的I mL氨水作為催化劑。為使合成的微球顯示，在反應(yīng)中加入染料，并可根據(jù)需要選擇不同顏色的染料對(duì)微球進(jìn)行染色以形成多種顏色的彩球。為減小微球之間的團(tuán)聚，加入一定量的硅烷偶聯(lián)劑5%KH-550或其他硅烷偶聯(lián)劑在微球表面引入氨基，增大微球表面電位以促進(jìn)微球之間的分散，形成單分散微球。經(jīng)試驗(yàn)證明，染料一部分以包埋的形式被包裹在微球中，另一