一種土壤中殘留bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免 疫定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著轉(zhuǎn)Bt作物種植面積的不斷擴大，其對生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險也日益成 為國內(nèi)外專家和學(xué)者研究的熱點。轉(zhuǎn)Bt作物在種植以后，在其整個生長期內(nèi)，會通過根系 分泌物、花粉、植物殘茬向土壤釋放Bt毒素，這些分泌的Bt毒素會被土壤中的粘土礦物和 腐殖質(zhì)等表面活性顆粒吸附，且該結(jié)合態(tài)毒素仍具有較強的殺蟲活性，在土壤環(huán)境中可長 時間存留。土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場所，土壤中的動物和微生物種 群對于土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)降解和能量轉(zhuǎn)換起著非常重要的作用。這些殘留的毒素可能會 對土壤中無脊椎動物、微生物種群產(chǎn)生潛在的毒性，影響土壤動物及微生物種群的多樣性 結(jié)構(gòu)，從而破壞土壤的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換。因此，研究轉(zhuǎn)Bt基因植物毒蛋白在土壤中的 殘留和降解動態(tài)對于保護生態(tài)環(huán)境安全具有十分重要的意義。
[0003] 目前，對于土壤中殘留Bt蛋白的檢測方法，主要通過提取液從土壤中提取Bt蛋白 后進行ELISA法檢測。目前提取土壤中殘留Bt蛋白的方法主要有SDS法，碳酸鹽法、人造 蠕蟲腸道蛋白提取液法、PBST試劑盒法等方法。上述這些方法在土壤殘留Bt蛋白檢測中 發(fā)揮了一定的作用，但是也都存在一定的缺陷?，F(xiàn)有的這些檢測土壤bt蛋白的方法，均為 先用提取液提取bt蛋白后，再進行檢測，該方法操作簡單，但是用于土壤這種吸附力很強 的介質(zhì)的時候，往往效果不會很理想，一些牢固吸附在土壤顆粒表面的bt蛋白很難被洗脫 下來，因此不能反映土壤中Bt蛋白的真實殘留含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明針對目前現(xiàn)有土壤Bt蛋白檢測方法的弊端，研發(fā)出了一種新的 直接在土壤顆粒表面進行原位酶聯(lián)免疫定量檢測bt蛋白的方法，該方法可以不經(jīng)過提取 直接精確檢測出吸附于土壤顆粒表面的難提取bt蛋白，真實反映出土壤中Bt蛋白的殘留 情況。同時，結(jié)合現(xiàn)有的檢測提取液中bt蛋白的方法，兩者的數(shù)據(jù)相加，可以完整的得到土 壤中bt蛋白的真實含量。本發(fā)明為監(jiān)測Bt蛋白在土壤中的殘留及其對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影 響提供了一條新的途徑，而且本方法不僅僅可以用于土壤bt蛋白的檢測，在更換不同的抗 體后更可以用于檢測各種土壤中的殘留蛋白含量。
[0005] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種土壤中殘留Bt蛋白的原位 酶聯(lián)免疫定量檢測方法，包括以下步驟：
[0006] 1)去除待測土樣中的動植物殘體，充分研磨，通過50-60目篩子使得土壤粒徑在 0. 2mm以下；
[0007] 2)將研磨后的土樣在高壓濕熱條件下滅菌15-20分鐘；
[0008] 3)稱取滅菌后的土樣l-2g，放入IOml離心管中進行清洗去除土壤雜質(zhì)；
[0009] 4)對去除過雜質(zhì)的土壤土樣表面進行封閉；
[0010] 5)對封閉后的土壤土樣進行抗體結(jié)合檢測：
[0011] 5. 1)向封閉后的土樣中加入3ml反應(yīng)液I，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫， 50rpm/min，孵育2h，期間每隔20min顛倒離心管數(shù)次，之后10000rpm/min離心5min，棄上 清液；
[0012] 5. 2)加入洗滌液II，充分搖勾后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min ;之 后10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0013] 5. 3)重復(fù)步驟5. 2)三到五次；
[0014] 5. 4)加入3ml反應(yīng)液II，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，50rpm/min，孵育lh，期 間每隔20min顛倒離心管數(shù)次，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0015] 5. 5)加入洗滌液II，充分搖勾后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min ;之 后10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0016] 5. 6)重復(fù)步驟5. 5三到五次；
[0017] 5. 7)加入新鮮配置的3ml TMB顯色液，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，IOOrpm/ min，孵育30min，期間每隔IOmin顛倒離心管數(shù)次，孵育結(jié)束后加入2M硫酸Iml終止反應(yīng)， 之后10000rpm/min離心5min，取上清液于酶標(biāo)儀450nm進行檢測。
[0018] 其中，上述步驟3)中去除土壤雜質(zhì)步驟如下：
[0019] 3. 1)加入洗滌液I 3ml，充分搖勾后，水平置于搖床，室溫，200rpm/min，震蕩 lOmin，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0020] 3. 2)重復(fù)步驟 3. 1) -次；
[0021] 3. 3)加入洗滌液II 3ml，充分搖勾后，水平置于搖床，37°C，200rpm/min，震蕩 5min，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0022] 3. 4)重復(fù)步驟3. 3)，直到上清液不再有泡沫。
[0023] 其中，上述步驟4)中土樣表面進行封閉步驟如下：
[0024] 4. 1)向洗滌后的土樣中加入3ml封閉液，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫， 50rpm/min，孵育lh，期間每隔IOmin顛倒離心管數(shù)次，之后10000rpm/min離心5min，棄上 清液；
[0025] 4. 2)加入洗滌液II，充分搖勾后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min ;之 后10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0026] 4. 3)重復(fù)步驟4. 2)三到五次即可。
[0027] 其中，上述洗滌液 I 配方為：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L， KH2P042mmol/L,2% (m/v) SDS, 0. 2mmol/L EDTA〇
[0028] 其中，上述洗滌液II配方為：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L， KH2P042mmol/L。
[0029] 其中，上述封閉液配方為：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L， KH2P042mmo1 /1,,8? m/vBSA，0· 5% v/vTween_20〇
[0030] 其中，上述反應(yīng)液 I 配方：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L， KH2P042mmol/L，5% m/vBSA，0· 5% v/vTween-20, 0· 5% v/vBt 蛋白抗體。
[0031] 其中，上述反應(yīng)液 II 配方：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L， KH2P042mmol/L, 5% m/vBSA，0· 5% v/vTween-20, 0· 05% v/vHRP 標(biāo)記二抗。
[0032] 其中，上述TMB(3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺）顯色液的配制方法為：稱取 TMB(3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺）20mg，用無水乙醇IOml溶解，充分振蕩后加雙蒸水定容 到1001111，此為底物4;取一水檸檬酸2.1 8，無水似2即04 2.828,0.75%的過氧化氫尿素 0. 64ml，雙蒸水定容至100mL，此為底物B ;使用時A :B各取I. 5ml混勻。
[0033] 有益效果：本發(fā)明為監(jiān)測Bt蛋白在土壤中的殘留及其對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提 供了一條新的途徑，而且本方法不僅僅可以用于土壤bt蛋白的檢測，在更換不同的抗體后 更可以用于檢測各種土壤中的殘留蛋白含量。
【具體實施方式】
[0034] 下面對本發(fā)明技術(shù)方案進行詳細說明，但是本發(fā)明的保護范圍不局限于所述實施 例。
[0035] 實施例1
[0036] 本方案中所采用的土壤樣品分別取自南京地區(qū)連續(xù)一年，兩年和五年種植轉(zhuǎn)Bt 棉花和常規(guī)棉的棉田，采樣地點為南京六合。
[0037] 在棉花的花期，轉(zhuǎn)Bt棉田與常規(guī)棉田隨機采集土樣，采用5點采樣法，每塊棉田設(shè) 置5個米樣點。每個取樣點相距30~50m，在每個米樣點周圍隨機選取5株棉花，在每株棉 花的根際周圍（距主根5cm內(nèi)，距地表5~20cm)共取500g左右土壤，裝入密封袋，作為一 個試驗樣品。采集的樣品帶回實驗室，-20Γ冰箱保存待測。
[0038] 取l_2g 土壤，按如下步驟進行：
[0039] 1.去除待測土樣中的動植物殘體，充分研磨，使得土壤粒徑在0. 2mm以下（可通過 50-60目篩子）；
[0040] 2. 土樣在高壓濕熱條件下（103. 4千帕蒸汽壓，121. 3°C )滅菌15-20分鐘；
[0041] 3.取滅菌后的土樣放入IOml離心管中，按下述步驟去除土壤雜質(zhì)：
[0042] 3. 1 加入洗滌液 I (洗滌液 I 配方：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L， Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L，2% (m/v)SDS，0.2mmol/L EDTA)3ml，充分搖勻后，水平置 于搖床，室溫，200rpm/min，震蕩lOmin。之后lOOOOrpm/min離心5min，棄上清液；
[0043] 3. 2重復(fù)步驟3. 1 -次；
[0044] 3. 3 加入洗滌液 II (洗滌液 II 配方：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L， Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L) 3ml，充分搖勻后，水平置于搖床，37°C，200rpm/min，震蕩 5min〇之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0045] 3. 4重復(fù)步驟3. 3,直到上清液不再有泡沫。
[0046] 4.按下述步驟對土樣表面進行封閉：
[0047] 4. 1向洗滌后的土樣中加入3ml封閉液（封閉液配方：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP0410mmol/L，KH2P0 42mmol/L，8% (m/v)BSA，0.5% (v/v)Tween-20)，充分 搖勻后，水平置于搖床，室溫，50rpm/min，孵育lh，期間每隔IOmin顛倒離心管數(shù)次。之后 10000rpm/min離心5min，棄上清液；
[0048] 4. 2加入洗滌液II，充分搖勾后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min ;之 后1000