0rpm/min離心5min,棄上清液;
[0049] 4.3重復(fù)步驟4.2三到五次。
[0050] 5.按下述步驟進(jìn)行抗體結(jié)合檢測(cè):
[0051] 5. 1向封閉后的土樣中加入3ml反應(yīng)液I (反應(yīng)液I配方:NaCl 137mmol/ L,KC12. 7mmol/L,Na2HP0410mmol/L,KH2P042mmol/L,5 % (m/v)BSA,0. 5 % (v/v) Tween-20, 0. 5% (v/v)Bt蛋白抗體),充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,50rpm/min,孵育 2h,期間每隔20min顛倒離心管數(shù)次。之后10000rpm/min離心5min,棄上清液;
[0052] 5. 2加入洗滌液II,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,100rpm/min,震蕩5min ;之 后10000rpm/min離心5min,棄上清液;
[0053] 5. 3重復(fù)步驟5. 2三到五次;
[0054] 5. 4 加入 3ml 反應(yīng)液 II (反應(yīng)液 II 配方:NaCl 137mmol/L,KCl 2. 7mmol/L, Na2HP0410mmol/L,KH2P042mmol/L,5 % (m/v) BSA,0· 5 % (v/v) Tween-20, 0· 05 % (v/v) HRP 標(biāo) 記二抗),充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,50rpm/min,孵育lh,期間每隔20min顛倒離心 管數(shù)次。之后l〇〇〇〇rpm/min離心5min,棄上清液;
[0055] 5. 5加入洗滌液II,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,100rpm/min,震蕩5min ;之 后10000rpm/min離心5min,棄上清液;
[0056] 5. 6重復(fù)步驟5. 5三到五次;
[0057] 5. 7加入新鮮配置的3ml TMB顯色液(TMB顯色液配方:稱(chēng)取TMB 20mg,用無(wú)水乙 醇IOml溶解,充分振蕩后加雙蒸水定容到100mL,此為底物A ;底物B,取一水檸檬酸2. lg, 無(wú)水似2即04 2.828,0.75%的過(guò)氧化氫尿素0.641111,雙蒸水定容至1001111。使用時(shí)4出各 取I. 5ml混勾),充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,100rpm/min,孵育30min,期間每隔IOmin 顛倒離心管數(shù)次。孵育結(jié)束后加入2M硫酸Iml終止反應(yīng)。之后10000rpm/min離心5min, 取上清液于酶標(biāo)儀450nm進(jìn)行檢測(cè);
[0058] 對(duì)比例1
[0059] 取l_2g 土壤(土壤樣本與實(shí)施例1 一樣),采取SDS法[ZL201010137168. 9]進(jìn)行 Bt蛋白提取檢測(cè),按如下步驟:
[0060] 1.取100g 土壤樣品,采用孔徑為48 μπι的網(wǎng)篩過(guò)篩去除植物根系殘?bào)w等雜質(zhì),稱(chēng) 取5g過(guò)篩后的土壤樣品置于研缽中,研磨Imin使土壤顆粒細(xì)小均勻;
[0061] 2.將0. 5g研磨后的土壤樣品置于2mL離心管中,加入I. 5mL SDS提取液,置于渦 旋混合儀上振蕩lmin,使其充分混合均勻;
[0062] 3.將上述土壤懸浮液置于可控溫?fù)u床中,50°C下200r · min 1振蕩4~16h ;
[0063] 4.將振蕩后的離心管取出,迅速置于離心機(jī)中,12000r · min 1離心1~2min ;
[0064] 5.離心結(jié)束后,用微量移液器小心吸取離心管中的上清液,轉(zhuǎn)入新的離心管中,該 上清液即為含有Bt蛋白的溶液;
[0065] 6.采用ELISA試劑盒對(duì)含有Bt蛋白的溶液進(jìn)行定量。
[0066] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0067] 本發(fā)明的土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法與SDS法 [ZL201010137168. 9]提取土壤Bt蛋白的含量比較結(jié)果
[0068] 表1兩種方法提取棉田土壤Bt蛋白結(jié)果:
[0069]
[0070] 由上表可見(jiàn),采用SDS法洗脫下來(lái)的土壤Bt蛋白只占土壤總Bt蛋白的百分之一 左右,說(shuō)明土壤中的Bt蛋白大部分是以吸附結(jié)合方式存在于土壤中,很難被洗脫下來(lái),而 采用本發(fā)明可以檢測(cè)出這部分與土壤顆粒緊密結(jié)合的Bt蛋白,從而精確的測(cè)定出土壤中 Bt蛋白真實(shí)的含量。
[0071] 另外,通過(guò)檢測(cè)種植不同年限的轉(zhuǎn)Bt棉花棉田土壤后我們發(fā)現(xiàn),土壤吸附的Bt蛋 白含量并未隨著種植年限的增長(zhǎng)而增加,可能說(shuō)明土壤對(duì)Bt蛋白的吸附及保護(hù)作用有一 定的飽和量,Bt蛋白不會(huì)累積。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其特征在于,包括以下步 驟: 1) 去除待測(cè)土樣中的動(dòng)植物殘?bào)w,充分研磨,通過(guò)50-60目篩子使得土壤粒徑在0. 2mm 以下; 2) 將研磨后的土樣在高壓濕熱條件下滅菌15-20分鐘; 3) 稱(chēng)取滅菌后的土樣l_2g,放入IOml離心管中進(jìn)行清洗去除土壤雜質(zhì); 4) 對(duì)去除過(guò)雜質(zhì)的土壤土樣表面進(jìn)行封閉; 5) 對(duì)封閉后的土壤土樣進(jìn)行抗體結(jié)合檢測(cè): 5. 1)向封閉后的土樣中加入3ml反應(yīng)液I,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,50rpm/ min,孵育2h,期間每隔20min顛倒離心管數(shù)次,之后10000rpm/min離心5min,棄上清液; 5. 2)加入洗滌液II,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,100rpm/min,震蕩5min ;之后 10000rpm/min離心5min,棄上清液; 5. 3)重復(fù)步驟5. 2)三到五次; 5. 4)加入3ml反應(yīng)液II,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,50rpm/min,孵育lh,期間每 隔20min顛倒離心管數(shù)次,之后10000rpm/min離心5min,棄上清液; 5. 5)加入洗滌液II,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,100rpm/min,震蕩5min ;之后 10000rpm/min離心5min,棄上清液; 5. 6)重復(fù)步驟5. 5三到五次; 5. 7)加入新鮮配置的3ml TMB顯色液,充分搖勻后,水平置于搖床,室溫,100rpm/min, 孵育30min,期間每隔IOmin顛倒離心管數(shù)次,孵育結(jié)束后加入2M硫酸Iml終止反應(yīng),之后 10000rpm/min離心5min,取上清液于酶標(biāo)儀450nm進(jìn)行檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其特 征在于,所述步驟3)中去除土壤雜質(zhì)步驟如下: 3. 1)加入洗滌液I 3ml,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,200rpm/min,震蕩lOmin,之 后10000rpm/min離心5min,棄上清液; 3. 2)重復(fù)步驟3. 1) -次; 3. 3)加入洗滌液II 3ml,充分搖勾后,水平置于搖床,37°C,200rpm/min,震蕩5min,之 后10000rpm/min離心5min,棄上清液; 3. 4)重復(fù)步驟3. 3),直到上清液不再有泡沫。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其特 征在于,所述步驟4)中土樣表面進(jìn)行封閉步驟如下: 4. 1)向洗滌后的土樣中加入3ml封閉液,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,50rpm/ min,孵育lh,期間每隔IOmin顛倒離心管數(shù)次,之后10000rpm/min離心5min,棄上清液; 4. 2)加入洗滌液II,充分搖勾后,水平置于搖床,室溫,100rpm/min,震蕩5min ;之后 10000rpm/min離心5min,棄上清液; 4. 3)重復(fù)步驟4. 2)三到五次即可。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其特 征在于,所述洗滌液I配方為:NaCl 137mmol/L,KCl 2. 7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L,2°/〇 (m/v) SDS, 0. 2mmol/L EDTA。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其特 征在于,所述洗滌液 II 配方為:NaCl 137mmol/L,KCl 2. 7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其 特征在于,所述封閉液配方為:NaCl 137mmol/L,KCl 2. 7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L,8%m/vBSA,0? 5%v/vTween_20。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其 特征在于,所述反應(yīng)液 I 配方:NaCl 137mmol/L,KCl 2. 7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L, 5%m/vBSA, 0. 5%v/vTween_20, 0? 5%v/vBt 蛋白抗體。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其 特征在于,所述反應(yīng)液II配方:NaCl 137mmol/L,KCl 2. 7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L, 5%m/vBSA,0? 5%v/vTween_20, 0? 05%v/vHRP 標(biāo)記二抗。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,其特 征在于,所述TMB顯色液的配制方法為:稱(chēng)取TMB 20mg,用無(wú)水乙醇IOml溶解,充分振蕩后 加雙蒸水定容到100 ml,此為底物A ;取一水檸檬酸2. lg,無(wú)水Na2HP04 2. 82g,0. 75%的過(guò) 氧化氫尿素〇. 64ml,雙蒸水定容至100ml,此為底物B ;使用時(shí)A :B各取I. 5ml混勻。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法,包括以下步驟:1)去除待測(cè)土樣中的動(dòng)植物殘?bào)w,充分研磨,通過(guò)50-60目篩子使得土壤粒徑在0.2mm以下;2)將研磨后的土樣在高壓濕熱條件下滅菌15-20分鐘;3)稱(chēng)取滅菌后的土樣1-2g,放入10ml離心管中進(jìn)行清洗去除土壤雜質(zhì);4)對(duì)去除過(guò)雜質(zhì)的土壤土樣表面進(jìn)行封閉;5)對(duì)封閉后的土壤土樣進(jìn)行抗體結(jié)合檢測(cè);本發(fā)明為監(jiān)測(cè)Bt蛋白在土壤中的殘留及其對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提供了一條新的途徑,而且本方法不僅僅可以用于土壤bt蛋白的檢測(cè),在更換不同的抗體后更可以用于檢測(cè)各種土壤中的殘留蛋白含量。
【IPC分類(lèi)】G01N33/535
【公開(kāi)號(hào)】CN105137061
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510452807
【發(fā)明人】方志翔, 劉標(biāo), 沈文靜, 李衍亮
【申請(qǐng)人】環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日