一種預(yù)測(cè)胰腺癌病人預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過測(cè)定胰腺癌組織標(biāo)本趨化因子 CXCL12及趨化因子受體CXCR7表達(dá)強(qiáng)弱，預(yù)測(cè)胰腺癌病人預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，其臨床表現(xiàn)隱匿、病情進(jìn)展 迅速、預(yù)后極差。85%的患者就診時(shí)已屬晚期，僅20%左右的患者可行手術(shù)治療，總體5年 生存率小于5%，因此國際上將其稱為"二十一世紀(jì)醫(yī)學(xué)的頑固堡皇"。近年來，胰腺癌發(fā)病 率在世界范圍內(nèi)逐年攀升。在西方國家，胰腺癌已經(jīng)成為十種最常見的惡性腫瘤之一，死亡 率居惡性腫瘤死亡原因的第四位。美國在過去10年中胰腺癌的發(fā)病率升高了三倍；我國胰 腺癌發(fā)病亦呈迅猛增長之勢(shì)。在北京、生海、天津等大城市，其發(fā)病率在20年間增長了約4 倍，發(fā)病率和死亡率上升了 50 %左右。
[0003] 外科手術(shù)是治療胰腺癌的最直接方式，也是提高胰腺癌患者遠(yuǎn)期生存率的最有效 手段。在我國多數(shù)患者到醫(yī)院就診時(shí)已處于胰腺癌晚期，手術(shù)切除率一般在10%左右。根 治性外科手術(shù)治療是胰腺癌治療的首選的治療方式，包括標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù)以及擴(kuò)大根治術(shù)。兩 種術(shù)式均立足于傳統(tǒng)的胰十二指腸切除的基礎(chǔ)之上，即腫瘤完全切除，胰頭切除，肝門以下 膽管切除，十二指腸切除，部分空腸切除，部分胃切除。擴(kuò)大根治術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù)的主要差 異在于淋巴結(jié)的清掃，即擴(kuò)大根治術(shù)除外常規(guī)的淋巴結(jié)清掃外，在進(jìn)行淋巴結(jié)清掃時(shí)，采取 經(jīng)后腹膜途徑擴(kuò)大進(jìn)行廣泛區(qū)域的淋巴結(jié)清掃。雖然根治性手術(shù)可以極大的改善患者的遠(yuǎn) 期生存率，然而由于胰腺癌的早期診斷難，患者在就診時(shí)往往已經(jīng)失去了根治性手術(shù)的機(jī) 會(huì)，因而在大多數(shù)臨床病例中，姑息性手術(shù)也成為重要的手術(shù)方式。姑息性手術(shù)主要目的為 解除黃疸以及胃腸道梗阻。姑息性手術(shù)雖然對(duì)于延長生存時(shí)間沒有太大意義，但是可以確 實(shí)的減輕患者的腫瘤負(fù)擔(dān)，解除疼痛，從而可以提高患者的生存質(zhì)量。
[0004] 與單純手術(shù)相比，術(shù)后輔助化療具有明確的療效，可以防止或延緩腫瘤復(fù)發(fā)，提高 術(shù)后長期生存率，因此，積極推薦術(shù)后實(shí)施輔助化療。胰腺癌具有對(duì)化療藥物的多藥耐藥 性，但化療仍是最常用的方法，若不進(jìn)行化療，其中位生存時(shí)間僅約3~4個(gè)月。全身化療 目前國際及國內(nèi)均已將吉西他濱作為胰腺癌化療的一線用藥，雖然其療效僅在20%左右， 但目前仍無可以超越吉西他濱的藥物。此外，胰腺癌的術(shù)后綜合治療還包括術(shù)后放療、分子 靶向治療、免疫治療等等。
[0005] 盡管關(guān)于胰腺癌治療的研究正如火如荼地進(jìn)行，但很少有研究著眼于胰腺癌患者 預(yù)后的評(píng)估，亦沒有有效的方法及產(chǎn)品評(píng)估胰腺癌患者預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本實(shí)驗(yàn)室通過前期研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中CXCL12和CXCR7共同高表達(dá)是影響患 者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為了評(píng)估胰腺癌患者的預(yù)后，基于以上原理，本發(fā)明提供了一種 預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒及CXCL12和CXCR7作為標(biāo)記物在體外評(píng)估胰腺癌 預(yù)后中的應(yīng)用，即通過免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定胰腺癌患者組織標(biāo)本中CXCL12及CXCR7表 達(dá)的高低，可以快速、安全、方便、有效地預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)，為臨床診治提供依 據(jù)。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：
[0008] -種預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，包括：用于特異性檢測(cè)胰腺癌組織 中趨化因子CXCL12及趨化因子受體CXCR7的表達(dá)的試劑。
[0009] 進(jìn)一步地，用于特異性檢測(cè)胰腺癌組織中趨化因子CXCL12的試劑包括抗CXCL12 的抗體，用于特異性檢測(cè)胰腺癌組織中趨化因子受體CXCR7的表達(dá)的試劑包括抗CXCR7的 抗體。
[0010] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：攜帶有可檢測(cè)信號(hào)分子的檢測(cè)抗體。
[0011] 優(yōu)選地，攜帶有可檢測(cè)信號(hào)分子的檢測(cè)抗體包括生物素化二抗和鏈親和素標(biāo)記的 HRP0
[0012] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括：顯色液、H 20 2、二甲苯、乙醇、TBS、抗原修復(fù)液、封 閉液和中性樹脂。
[0013] 優(yōu)選地，所述顯色液包括DAB和蘇木精，所述抗原修復(fù)液為檸檬酸緩沖液，所述封 閉液為與抗CXCL12的抗體和抗CXCR7的抗體同種屬來源的血清，亦可以為小牛血清、BSA、 羊血清等。
[0014] 本發(fā)明還提供了趨化因子CXCL12和趨化因子受體CXCR7作為標(biāo)記物在制備預(yù)測(cè) 胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的應(yīng)用。
[0015] 以及趨化因子CXCL12和趨化因子受體CXCR7作為標(biāo)記物在體外評(píng)估胰腺癌患者 預(yù)后中的應(yīng)用。
[0016] 進(jìn)一步地，當(dāng)胰腺癌患者組織標(biāo)本中趨化因子CXCL12及趨化因子受體CXCR7共同 高表達(dá)時(shí)，表示預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高；當(dāng)胰腺癌患者組織標(biāo)本中趨化因子CXCL12或趨化因 子受體CXCR7低表達(dá)時(shí)，表示預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)低。
[0017] 進(jìn)一步地，通過以下方法判定胰腺癌患者組織標(biāo)本中趨化因子CXCL12及趨化因 子受體CXCR7的表達(dá)情況：顯微鏡下觀察染色的胰腺癌組織切片，陽性結(jié)果成棕黃色顆粒 樣染色，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。陽性細(xì)胞數(shù)比例0%，1-30%，31-60% 及大于60%分別判定為0、1、2、3分。每張切片陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃 色及棕褐色分別判讀為0、1、2、3分。將兩項(xiàng)積分的乘積結(jié)果作為最后綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，最后 綜合評(píng)分的范圍為0-9分，其中0-3分判定為低表達(dá)，4-9分判定為高表達(dá)。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發(fā)明的試劑盒通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胰腺癌組織中CXCR7及CXCL12表達(dá) 的高低，預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。本檢測(cè)方法快速、安全、方便、靈敏，易于推廣，可以 為胰腺癌的臨床診治提供依據(jù)。
【附圖說明】
[0020] 圖1是CXCL12和CXCR7在癌組織及癌旁組織中表達(dá)情況；
[0021] 圖2是CXCL12和CXCR7表達(dá)情況的Cox生存分析。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 :利用本發(fā)明的試劑盒對(duì)胰腺癌組織（標(biāo)本來源于161例胰腺癌患者手 術(shù)切除的癌組織，其中男性患者104人，女性患者57人，年齡跨度為34-85歲，中位年齡59 歲）表達(dá)的趨化因子CXCL12及趨化因子受體CXCR7進(jìn)行檢測(cè)
[0023] 本實(shí)施例中的胰腺癌預(yù)后試劑盒，由以下組分構(gòu)成：
[0024] (1)試劑A :封閉液，為10%山羊血清；
[0025] (2)試劑B :已稀釋的即用型抗CXCL12 -抗；
[0026] (3)試劑C :已稀釋的即用型抗CXCR7 -抗；
[0027] (4)試劑D :抗山羊生物素化二抗；
[0028] (5)試劑E :鏈親和素標(biāo)記的HRP ;
[0029] (6)試劑F : 20倍濃縮DAB底物溶液；
[0030] (7)試劑G : 20倍濃縮DAB底物緩沖溶液；
[0031] (8)試劑H :20倍濃縮DAB顯色溶液。
[0032] 其中試劑B、C原裝進(jìn)口分裝即用型抗體，稀釋倍數(shù)為1 :500 ;試劑D原裝進(jìn)口分裝 即用型抗體，稀釋倍數(shù)為I :400試劑A、D、E、F、G、H為原裝進(jìn)口分裝。
[0033] (其中試劑 B 為 SDF-I (C-19) : sc-6193, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.
[0034] 試劑 C 為 CXCR-7 (1-13) : sc-107515, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.
[0035] 試劑 D 為 donkey anti-goat IgG-B: sc-2042, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.
[0036] 試劑 E 為 Horseradish peroxidase (HRP)，RZ I. 0 :sc-280786, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.
[0037] 試劑F、G、H購置于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：DAB-0031/1031) 除外試劑盒中包含的以上試劑，用戶可自行而配制或購買以下試劑：
[0038] (1)蒸餾水或去離子水；
[0039] (2)3% H2O2;
[0040] (3)二甲苯；
[0041] (4) 75%、85%、95 %酒精及無水乙醇；
[0042] (5) IOmM TBS溶液（ρΗ7· 2~L 4):三羥基氨基甲烷L 21g，氯化鈉 L 6g，加蒸餾水 800mL，濃鹽酸調(diào)pH值至L 2~L 4,最后定容至1000 mL ;
[0043] (6) IOmM ρΗ6· 0檸檬酸緩沖液：梓檬酸0· 38g，檸檬酸三鈉2. 45g，加蒸餾水900mL， 濃鹽酸調(diào)pH值至6. 0,最后