定容至1000 mL ;
[0044] (7)蘇木精溶液；
[0045] (8)中性樹脂。
[0046] 利用上述試劑盒檢測胰腺癌組織中趨化因子CXCL12及趨化因子受體CXCR7的表 達(dá)：
[0047] (1)組織包埋：10%的中性福爾馬林固定胰腺癌組織標(biāo)本2h，用流水反復(fù)沖洗以 去除固定液，將標(biāo)本放置入75%酒精過夜，然后采用酒精梯度脫水，75%酒精lh，85%酒精 lh，95%酒精lh，無水乙醇2次，每次1.5h，然后置于二甲苯中浸泡1.5h，60°C烘箱中浸蠟 Ih包埋，冷卻后4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0048] (2)石蠟切片：修整蠟塊，調(diào)整切片機(jī)（SLEE石蠟切片機(jī)⑶T5062)將切片厚度設(shè) 為3~4 μπι，連續(xù)切片，置于60°C溫水漂浮展平，平鋪于涂有陽離子樹脂的載玻片上；
[0049] (3)烤片：將待做切片置于切片架上，于60°C恒溫烤箱中至少烤Ih ;
[0050] (4)脫蠟：切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次（即二甲苯I、II、111)，每次 IOmin ；
[0051] (5)水化：切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min)，85% 乙醇2min ;75%乙醇2min，蒸餾水沖洗1分鐘；
[0052] (6)抗原修復(fù)：高壓鍋中加入檸檬酸緩沖液1000ml，將裝有切片的切片架浸入緩 沖液中，高溫高壓修復(fù)2分45秒，用TBS洗滌3次，每次2min ;
[0053] (7) 3% H2O2滴加在切片上，室溫靜置15min，TBS洗滌3次，每次2min ;
[0054] (8)封閉：滴加試劑A于切片上，需完全覆蓋組織切片，室溫孵育IOmin后吸干液 體，無需沖洗；
[0055] (9)加一抗：不同的切片分別滴加試劑B (抗CXCL12 -抗）及試劑C(抗CXCR7 - 抗），需完全覆蓋組織切片，37°C濕盒孵育2hr或4°C過夜；
[0056] (10)洗滌：TBS-T 洗滌（3X5min);
[0057] (11)加二抗：試劑D (滴加生物素化二抗），需完全覆蓋組織切片，37°C濕盒中孵育 30min ；
[0058] (12)洗滌：TBS洗滌3次，每次5min ;
[0059] (13)加 HRP-SA :滴加試劑E (鏈親和素標(biāo)記的HRP)，需完全覆蓋組織切片，37°C濕 盒中孵育30min ;
[0060] (14)洗滌：TBS洗滌3次，每次5min ;
[0061] (15)制備DAB顯色液：需現(xiàn)用現(xiàn)配，以染一張切片為例，取2. 5ul試劑F加入到 50ul蒸餾水中并混勻，再分別向上述液體中加入2. 5ul試劑G及2. 5ul試劑H，混勻。
[0062] (16)顯色：滴加上述DAB顯色液于切片上，需完全覆蓋組織切片，顯微鏡下觀察顯 色，蒸餾水沖洗終止顯色；
[0063] (17)復(fù)染：蘇木精復(fù)染3min，鹽酸酒精分化；
[0064] (18)封片：75%酒精浸泡2min，85%酒精浸泡2min，95%酒精浸泡2min，無水乙醇 浸泡2min，然后置于二甲苯中浸泡15min，更換二甲苯后再浸泡15min，中性樹脂封片；
[0065] (19)結(jié)果判讀：顯微鏡下觀察染色的胰腺癌組織切片，陽性結(jié)果成棕黃色顆粒樣 染色，隨機(jī)選擇5個高倍視野（10*40)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)。陽性細(xì)胞數(shù)比例0%，1-30%， 31-60%及大于60%分別判定為0、1、2、3分。每張切片陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按無著色、淡黃 色、棕黃色及棕褐色分別判讀為〇、1、2、3分。將兩項(xiàng)積分的乘積結(jié)果作為最后綜合評分標(biāo) 準(zhǔn)，最后綜合評分的范圍為0-9分，其中0-3分判定為低表達(dá)，4-9分判定為高表達(dá)。
[0066] 如圖1所示，A為胰腺癌組織CXCL12蛋白表達(dá)情況；B為胰腺癌癌旁正常胰腺組織 CXCL12蛋白表達(dá)情況；C為胰腺癌組織CXCR7蛋白表達(dá)情況；D為胰腺癌癌旁正常胰腺組織 CXCR7蛋白表達(dá)情況。
[0067] 實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒在預(yù)測胰腺癌病人預(yù)后中的應(yīng)用
[0068] 采用病例對照的研究方法并應(yīng)用小試生產(chǎn)的試劑盒，對161例接受根治性手術(shù)治 療的胰腺癌患者的組織標(biāo)本中趨化因子CXCL12及趨化因子受體CXCR7的表達(dá)進(jìn)行檢測， 并對胰腺癌患者進(jìn)行長期隨訪（每月進(jìn)行電話隨訪，隨訪87個月，期間病人發(fā)生死亡則不 再進(jìn)行隨訪），采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法研究胰腺癌組織表本中趨化因子CXCL12及趨化因子受體 CXCR7表達(dá)的強(qiáng)弱與患者預(yù)后的關(guān)系。如圖2所示，CXCL12和CXCR7共同高表達(dá)組的中位 生存期明顯短于CXCL12和CXCR7共同低表達(dá)組及CXCL12或CXCR7高表達(dá)組；相比CXCL12 和CXCR7共同低表達(dá)組及CXCL12或CXCR7高表達(dá)組，CXCL12和CXCR7共同高表達(dá)組的預(yù) 后更差（P = 〇. 002)。
[0069] 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出以下結(jié)論：
[0070] 表1.影響胰腺癌總生存期的多因素分析
[0071]
[0072] 如表1所示，將CXCLl 2和CXCR7共同高表達(dá)、性別、年齡、N分期、分化程度納入Cox 回歸模型進(jìn)行多因素分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明CXCL12和CXCR7共同高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú) 立危險因素，其P = 0.034。
[0073] 表2. CXCL12和CXCR7高表達(dá)情況對胰腺癌患者預(yù)后的影響
[0074]
[0075] 如表2所示，進(jìn)一步將CXCL12和CXCR7的表達(dá)情況進(jìn)行不同組合后分組，經(jīng)過 Cox生存分析發(fā)現(xiàn)CXCL12和CXCR7共同高表達(dá)的危險度為二者均低表達(dá)的1. 867倍，P = 0. 001。以上結(jié)果表明癌組織中CXCL12和CXCR7共同高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后不良的風(fēng)險 更高，預(yù)后更差。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險的試劑盒，包括：用于特異性檢測胰腺癌組織中 趨化因子CXCL12及趨化因子受體CXCR7的表達(dá)的試劑。2. 如權(quán)利要求1所述的預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險的試劑盒，其特征在于，用于特 異性檢測胰腺癌組織中趨化因子CXCL12的試劑包括抗CXCL12的抗體，用于特異性檢測胰 腺癌組織中趨化因子受體CXCR7的表達(dá)的試劑包括抗CXCR7的抗體。3. 如權(quán)利要求1所述的預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒還包括：攜帶有可檢測信號分子的檢測抗體。4. 如權(quán)利要求3所述的預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險的試劑盒，其特征在于，攜帶有 可檢測信號分子的檢測抗體包括生物素化二抗和鏈親和素標(biāo)記的HRP。5. 如權(quán)利要求1所述的預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒還包括：顯色液、H2O 2、二甲苯、乙醇、TBS、抗原修復(fù)液、封閉液和中性樹脂。6. 如權(quán)利要求5所述的預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險的試劑盒，其特征在于，所述顯 色液包括DAB和蘇木精，所述抗原修復(fù)液為檸檬酸緩沖液，所述封閉液為與抗CXCL12的抗 體和抗CXCR7的抗體同種屬來源的血清。7. 趨化因子CXCL12和趨化因子受體CXCR7作為標(biāo)記物在制備預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不 良風(fēng)險的試劑盒中的應(yīng)用。8. 趨化因子CXCL12和趨化因子受體CXCR7作為標(biāo)記物在體外評估胰腺癌患者預(yù)后中 的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)胰腺癌患者組織標(biāo)本中趨化因子CXCL12 及趨化因子受體CXCR7共同高表達(dá)時，表示預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險高；當(dāng)胰腺癌患者組織標(biāo)本 中趨化因子CXCL12或趨化因子受體CXCR7低表達(dá)時，表示預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險低。10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，通過以下方法判定胰腺癌患者組織標(biāo)本中 趨化因子CXCL12及趨化因子受體CXCR7的表達(dá)情況：顯微鏡下觀察染色的胰腺癌組織切 片，陽性結(jié)果成棕黃色顆粒樣染色，隨機(jī)選擇5個高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù) 比例0%，1-30%，31-60%及大于60%分別判定為0、1、2、3分，每張切片陽性細(xì)胞的著色強(qiáng) 度按無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色分別判讀為〇、1、2、3分，將兩項(xiàng)積分的乘積結(jié)果作為 最后綜合評分標(biāo)準(zhǔn)，最后綜合評分的范圍為0-9分，其中0-3分判定為低表達(dá)，4-9分判定為 高表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險的試劑盒及其應(yīng)用，即通過免疫組織化學(xué)的方法測定胰腺癌患者組織標(biāo)本中CXCL12及CXCR7表達(dá)的高低，以CXCL12和CXCR7作為標(biāo)記物在體外評估胰腺癌預(yù)后，可以快速、安全、方便、有效地預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良風(fēng)險，為臨床診治提供依據(jù)。
【IPC分類】G01N33/574
【公開號】CN105137078
【申請?zhí)枴緾N201510293740
【發(fā)明人】郭俊超, 趙玉沛, 張?zhí)? 周立, 李建, 由磊
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年6月1日