蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月14日提交的名稱(chēng)為"PROTEIN STANDARD(蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品）" 美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/784, 242的優(yōu)先權(quán)，其通過(guò)引用納入本文用于所有目的。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 蛋白質(zhì)凝膠電泳是分子生物學(xué)研究、制藥和其它企業(yè)廣泛應(yīng)用的技術(shù)。該技術(shù)可 用于分析生物樣品的蛋白質(zhì)含量，或純化足夠量的感興趣蛋白質(zhì)供于后續(xù)應(yīng)用。蛋白質(zhì)凝 膠電泳的基礎(chǔ)方面是檢測(cè)所述凝膠中的樣品蛋白質(zhì)，這允許表征這些蛋白質(zhì)的分子量、純 度、氨基酸含量等。為協(xié)助所述表征，本領(lǐng)域技術(shù)人員常常利用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品一一組良好表 征的蛋白質(zhì)，伴隨樣品蛋白質(zhì)在凝膠中跑動(dòng)。
[0005] 新技術(shù)已使電泳后的蛋白質(zhì)檢測(cè)具有更高靈敏度、更高特異度和更低成本。這些 技術(shù)中的許多都要求待檢測(cè)的蛋白質(zhì)具有特定特征，例如特定的氨基酸基序或共價(jià)連接的 化學(xué)基團(tuán)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文提供蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的方法，和用于檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的 試劑盒。
[0007] 提供用于凝膠電泳的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品包含多個(gè)蛋 白質(zhì)組，各組對(duì)應(yīng)于不同的凝膠條帶，其中至少一組包含標(biāo)記的蛋白質(zhì)，所述標(biāo)記的蛋白質(zhì) 包含（i)色氨酸殘基，和（ii)標(biāo)記物，所述標(biāo)記物與鹵烷基化色氨酸在光譜上不同。在其 它實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品包含多個(gè)蛋白質(zhì)組，各組對(duì)應(yīng)于不同的凝膠條帶，其中至少一組 包含未標(biāo)記的和標(biāo)記的蛋白質(zhì)的混合物，所述未標(biāo)記的蛋白質(zhì)包含色氨酸殘基，而所述標(biāo) 記的蛋白質(zhì)包含與鹵烷基化色氨酸在光譜上不同的標(biāo)記物。
[0008] 所述色氨酸殘基可共價(jià)連接至鹵代烷烴。所述鹵代烷烴可具有一個(gè)或兩個(gè)碳原子 或可選自下組，包括但不限于：三氯乙醇、三氯乙酸、氯仿和溴仿。
[0009] 在所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物是共價(jià)連接 至卟啉的氨基酸殘基。在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物是共價(jià)連接至染料的氨基酸殘基。
[0010] 所述染料可選自下組：?jiǎn)嗡{(lán)AdJniblue A)、中性紅、QXL610、QXL670、RGA黃、DEAC、 NBD-X、氟硼二吡咯（Bodipy) TMR-X、氟硼二吡咯TR-X、氟硼二吡咯530、氟硼二吡咯R6G、氟 硼二吡咯493、丹磺酰-X、氯高鐵血紅素和原卟啉IX。所述染料可以有顏色或發(fā)熒光。在一 些情況中，所述染料是熒光染料，并且所述染料的激發(fā)和發(fā)射光譜的峰落在可見(jiàn)光譜之內(nèi)。
[0011] 在所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或12個(gè)蛋白質(zhì)組包含如上所述的混合物。在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的所有蛋白質(zhì)組 包含所述混合物。而在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)蛋 白質(zhì)組包含如上所述的含有色氨酸殘基的蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的所有 蛋白質(zhì)組包括含有所述色氨酸殘基的蛋白質(zhì)。而在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)蛋白質(zhì)組包含如上所述的含有標(biāo)記物的蛋白質(zhì)。而在其它實(shí)施方 式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的所有蛋白質(zhì)組包括含有所述標(biāo)記物的蛋白質(zhì)。
[0012] 第一蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物可以與第二蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物在光譜 上不同。所述至少一組中標(biāo)記的蛋白質(zhì)還可包含（以平均計(jì)），少于2、5、10或20個(gè)所述標(biāo) 記物/分子。或者，所述至少一組中標(biāo)記的蛋白質(zhì)可包含（以平均計(jì)），多于2、5、10或20 個(gè)所述標(biāo)記物/分子。
[0013] 在所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的一些實(shí)施方式中，其中至少一個(gè)蛋白質(zhì)組包含未標(biāo)記的和 標(biāo)記的蛋白質(zhì)的混合物，所述至少一組中，標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子的比 例是至多1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1或10:1。在其它實(shí)施方式中，所述至少一組中的標(biāo) 記的蛋白質(zhì)的平均分子量超過(guò)同一組中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)的平均分子量至少1%、2%、5%、 10%或 20%。
[0014] 所述標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)組可對(duì)應(yīng)10~250kDa范圍內(nèi)的分子量，或具有至少1、2、5、 10、20、50或IOOkDa的分子量差異。在所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記的蛋 白質(zhì)的標(biāo)記物在還原劑的存在下穩(wěn)定。在其它實(shí)施方式中，所述至少一組還包含其它標(biāo)記 的蛋白質(zhì)，并且所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物與所述其它標(biāo)記的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物在光譜上不 同。
[0015] 在該提供的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中，至少一組中標(biāo)記的蛋白質(zhì)還可包含可檢測(cè)部分。所 述部分可以是，例如，染料、撲啉或多肽。在一些實(shí)施方式中，其中所述部分是多肽，所述多 肽存在于所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的N-或C-末端。在其它實(shí)施方式中，所述多肽共價(jià)連接至所 述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈。而在其它此類(lèi)實(shí)施方式中，所述多肽是識(shí)別序列。
[0016] 在一些情況中，所述識(shí)別序列是抗體結(jié)合表位。在其它情況中，所述識(shí)別序列是 親和標(biāo)簽。所述親和標(biāo)簽可以是Str印-標(biāo)簽，或例如包含氨基酸序列WTHPQFER(SEQ ID N0:1)〇
[0017] 在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品包含多個(gè)蛋白質(zhì)組，各組對(duì)應(yīng)于不同的凝膠 條帶，其中至少一組包括含有如下所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)：WTHPQFER(SEQ ID Ν0:1)、 AWRHPQFGG(SEQ ID Ν0:2)或WSHPQFEK(SEQ ID Ν0:3)。在其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品 包含多個(gè)蛋白質(zhì)組，各組對(duì)應(yīng)于不同的凝膠條帶，其中至少一組包括含有對(duì)鏈霉親和素或 Strep-Tactin具有結(jié)合親和性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在這些實(shí)施方式中的一些中，所述 至少一組的蛋白質(zhì)還包含標(biāo)記物，所述標(biāo)記物包含共價(jià)連接至染料的氨基酸殘基。此外，在 一些情況中，所述標(biāo)記物的氨基酸殘基不包含在所述氨基酸序列之內(nèi)。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品包含多個(gè)蛋白質(zhì)組，各組對(duì)應(yīng)于不同的凝膠條帶， 其中至少一組包含第一標(biāo)記的蛋白質(zhì)和第二標(biāo)記的蛋白質(zhì)的混合物，所述第一標(biāo)記的蛋白 質(zhì)包含第一標(biāo)記物，且所述第二標(biāo)記的蛋白質(zhì)包含第二標(biāo)記物，并且其中所述第一和第二 標(biāo)記物在光譜上不同。
[0019] 還提供一種在凝膠電泳之后檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的方法。在一些實(shí)施方式中，所述 方法包括：提供包含如上所述的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的電泳凝膠，和任選地檢測(cè)所述標(biāo)準(zhǔn)品。所述 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品能以如下濃度存在于所述凝膠中：例如，至少0. 5、1、2、5、10、20、30或40微克 總蛋白質(zhì)/泳道。所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品包含多個(gè)蛋白質(zhì)組，各組對(duì)應(yīng)于不同的凝膠條帶，并且 至少一個(gè)蛋白質(zhì)組可以如下濃度存在于所述凝膠中：至少〇. 1、〇. 2、0. 5、1、2、5或10微克/ 泳道。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括用紫外光照射所述凝膠，并檢測(cè)所述標(biāo)準(zhǔn)品 中任何鹵烷基化色氨酸殘基的熒光。所述紫外光的波長(zhǎng)可以是，例如，250-340nm。所述凝 膠還可包含鹵代烷烴，其在一些情況中可選自下組，包括但不限于：三氯乙醇、三氯乙酸、氯 仿和溴仿。
[0021] 所述方法的光學(xué)檢測(cè)可包括：用環(huán)境光或可見(jiàn)光照射所述凝膠。所述可見(jiàn)光的波 長(zhǎng)可以是，例如，400-700nm〇
[0022] 在所述方法的一些實(shí)施方式中，所述光學(xué)檢測(cè)包括：觀察由所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的 標(biāo)記物產(chǎn)生的顏色。在其它實(shí)施方式中，所述光學(xué)檢測(cè)包括：檢測(cè)所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的標(biāo)記 物對(duì)可見(jiàn)光的吸收或熒光再發(fā)射。而在其它實(shí)施方式中，所述方法還包括將所述標(biāo)記的蛋 白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至印跡膜，并檢測(cè)所述膜上的標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
[0023] 對(duì)于所述膜上的標(biāo)記的蛋白質(zhì)的檢測(cè)可包含：提供對(duì)所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物 或部分具有特異性的結(jié)合伴侶；用該結(jié)合伴侶孵育所述膜；和，檢測(cè)所述結(jié)合伴侶與所述 膜上的標(biāo)記的蛋白質(zhì)的相互作用。所述結(jié)合伴侶可以是蛋白質(zhì)，并且在一些情況中，是抗 體。所述結(jié)合伴侶與所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的相互作用可通過(guò)，例如，熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，其中所述方法包括檢測(cè)膜上的標(biāo)記的蛋白質(zhì)，所述標(biāo)記物或 部分是原卟啉IX。所述結(jié)合伴侶可以是魯米諾（Iuminol)，而所述結(jié)合伴侶與所述標(biāo)記的 蛋白質(zhì)的相互作用可通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
[0025] 在其它實(shí)施方式中，其中所述方法包括：檢測(cè)膜上的標(biāo)記的蛋白質(zhì)，所述部分 選自下組：Str印-標(biāo)簽I、Str印-標(biāo)簽II或STP1。所述結(jié)合伴侶可包含鏈霉親和素或 Strep-Tactin，并且所述結(jié)合伴侶與所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的相互作用可通過(guò)熒光或化學(xué)發(fā)光 檢測(cè)。
[0026] 在一些實(shí)施方式中，所述方法包括：提供蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品包含多個(gè) 蛋白質(zhì)組，各組對(duì)應(yīng)于不同的凝膠條帶，其中至少一組包含標(biāo)記的蛋白質(zhì)，所述標(biāo)記的蛋 白質(zhì)包含：含有共價(jià)連接至染料的氨基酸殘基和氨基酸序列WTHPQFER(SEQ ID N0:1)、 AWRHPQFGG(SEQ ID N0:2)或WSHPQFEK(SEQ ID N0:3)的標(biāo)記物；用可見(jiàn)光照射包含所述蛋 白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的凝膠；檢測(cè)所述標(biāo)記物對(duì)可見(jiàn)光的吸收或熒光再發(fā)射情況；將所述標(biāo)記的蛋 白質(zhì)轉(zhuǎn)移至印跡膜；用對(duì)所述氨基酸序列具有特異性的結(jié)合伴侶孵育所述膜；和檢測(cè)結(jié)合 至所述膜上的標(biāo)記的蛋白質(zhì)的結(jié)合伴侶。
[0027] 在該方法的一些實(shí)施方式中，所述至少一組還包括含有色氨酸殘基的未標(biāo)記的蛋 白質(zhì)，所述凝膠還包含鹵代烷烴，并且所述方法還包括：用紫外光照射所述凝膠，此時(shí)未標(biāo) 記的蛋白質(zhì)的色氨酸殘基與所述鹵代烷烴反應(yīng)以形成共價(jià)加合物；和檢測(cè)由所述共價(jià)加合 物的熒光產(chǎn)生的光。在該方法的其它實(shí)施方式中，所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)還包含色氨酸殘基，所 述凝膠還包含鹵代烷烴，并且所述方法還包括：用紫外光照射所述凝膠，此時(shí)標(biāo)記的蛋白質(zhì) 的色氨酸殘基與所述鹵代烷烴反應(yīng)以形成共價(jià)加合物；和檢測(cè)由所述共價(jià)加合物的熒光產(chǎn) 生的光。所述標(biāo)記物的氨基酸殘基可以是，例如，賴(lài)氨酸殘基。所述結(jié)合伴侶可包含鏈霉親 和素或 Strep-Tactin0
[0028] 還提供用于檢測(cè)凝膠中的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所述試劑 盒包含如上所述的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，和鹵代烷烴。所述試劑盒還可包含凝膠，其中所述鹵代烷 烴是所述凝膠的組分。在所述試劑盒的一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)記的蛋白質(zhì)包含 在印跡膜上可檢測(cè)的部分，并且所述試劑盒還包含用于該檢測(cè)的對(duì)所述部分具有特異性的 結(jié)合伴侶。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1顯示采用四種檢測(cè)方案對(duì)三種凝膠中的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，如實(shí)施例1中 描述。
[0030] 圖2顯不米用二種檢測(cè)方案對(duì)五種蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，如實(shí)施例2中描述。圖 2A顯示用環(huán)境光照射的包含所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的凝膠。圖2B顯示用紫外光照射的所述凝 膠。圖2C是將所述凝膠分別暴露至紅、綠和藍(lán)波長(zhǎng)光下獲得的合并圖像。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 本文提供用于凝膠電泳的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，其可用一種或多種檢測(cè)方案檢測(cè)。一般 而言，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品是一群蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在分子量、大小或其它性質(zhì)方面的均經(jīng)良好 表征。所述標(biāo)準(zhǔn)品通常在電泳凝膠上伴隨樣品蛋白質(zhì)或感興趣的蛋白質(zhì)一起跑動(dòng)。通過(guò)檢 測(cè)所述標(biāo)準(zhǔn)品和樣品蛋白質(zhì)，能夠比較所述標(biāo)準(zhǔn)品和樣品蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，由此通過(guò)實(shí)驗(yàn)表 征所述樣品蛋白質(zhì)。本文所述的多種檢測(cè)方案允許以多種方式表征所述樣品蛋白質(zhì)。
[0033] 本文所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品包含多個(gè)（例如，2、