標(biāo)記的群混合。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式 中，所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)具有多于2、5、10或20個(gè)標(biāo)記物/分子。
[0045] 在一個(gè)蛋白質(zhì)組中明確混合標(biāo)記的和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)允許所述標(biāo)記物和鹵烷基 化色氨酸存在于不同的分子上。這具有若干益處。首先，這阻止所述兩種化學(xué)基團(tuán)之間的 干擾，例如熒光共振能量的轉(zhuǎn)移或淬滅，所述干擾可歸因于物理上的接近，并抑制對(duì)其中一 種或這兩種基團(tuán)的光學(xué)檢測(cè)。第二，使所述兩種基團(tuán)處于不同的分子上，提供了對(duì)于標(biāo)記反 應(yīng)的更多選擇。例如，可采用其中標(biāo)記物能共價(jià)連接至色氨酸殘基的標(biāo)記化學(xué)法。所述化 學(xué)法阻止對(duì)于所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)上的色氨酸殘基的鹵烷基化和檢測(cè)，但不影響在所述反應(yīng) 之后混合進(jìn)入同一組的未標(biāo)記的蛋白質(zhì)上的色氨酸殘基。類似地，可利用與色氨酸不相容 的標(biāo)記化學(xué)法，通過(guò)將標(biāo)記的無(wú)色氨酸的蛋白質(zhì)與包含色氨酸的未標(biāo)記的蛋白質(zhì)混合來(lái)進(jìn) 行。
[0046] 將標(biāo)記的蛋白質(zhì)和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)混合還會(huì)造成所述蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)分子 量的異質(zhì)性。當(dāng)檢測(cè)鹵烷基化色氨酸和標(biāo)記物時(shí)，所述異質(zhì)性可使所述條帶與顯示兩分 (bifurcated)現(xiàn)象的組相關(guān)聯(lián)。在該情況中，兩分現(xiàn)象（bifurcation)是有利的，因?yàn)槠?在所述凝膠上顯示所述組中蛋白質(zhì)分子（即，攜帶鹵烷基化色氨酸的分子和攜帶所述標(biāo)記 物的分子）之間的較大物理分離，進(jìn)一步減少任何因接近所致的干擾。在所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 品的一些實(shí)施方式中，一個(gè)蛋白質(zhì)組中標(biāo)記的蛋白質(zhì)的平均分子量超過(guò)或大于同一組中未 標(biāo)記的蛋白質(zhì)的平均分子量，相差量為所述組中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)的平均分子量的至少1%、 2%、5%、10%或 20%。
[0047] 不論如何制備所述蛋白質(zhì)組，在一些實(shí)施方式中，所述組包含多于一種標(biāo)記的蛋 白質(zhì)。例如，所述組可包含用第一標(biāo)記物標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并且該同一蛋白質(zhì)（或相似的蛋白 質(zhì)）用第二標(biāo)記物標(biāo)記，其中所述第一和第二標(biāo)記物具有不同的化學(xué)組成。將所帶標(biāo)記不 同的蛋白質(zhì)混合，允許更采用多重方案進(jìn)行更強(qiáng)健的檢測(cè)。例如，一種標(biāo)記物可具有強(qiáng)色彩 和弱熒光；而另一種標(biāo)記物可具有強(qiáng)熒光和弱色彩。所述混合物允許對(duì)色彩和熒光兩者的 強(qiáng)健檢測(cè)。這是當(dāng)所述標(biāo)記物是，例如，染料單藍(lán)A和NBD-X時(shí)的情況。在一些實(shí)施方式中， 所述第一和第二標(biāo)記物在光譜上不同。在此類實(shí)施方式中，一種標(biāo)記物可不與齒烷基化色 氨酸在光譜上不同，但可在暴露至紫外光下時(shí)，以替代或額外于鹵烷基化色氨酸的方式被 檢測(cè)。
[0048] 所述至少一個(gè)蛋白質(zhì)組的標(biāo)記的蛋白質(zhì)還可包含可檢測(cè)部分。所述部分可以是卟 啉或染料，除了卟啉或染料以外可包含如上所述的標(biāo)記物。不意在限制，所述部分可以共價(jià) 連接至所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈，或連接至所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的N-或C-末端。用 于連接多于一種可檢測(cè)的化學(xué)基團(tuán)（不同于相同組的多重拷貝）的方法是本領(lǐng)域已知的， 并且可見(jiàn)于，例如，Johnson 和 Spence (編），Molecular Probes Handbook-A Guide to 焚 光Probes and Labeling Technologies (《分子探針手冊(cè)--焚光探針和標(biāo)記技術(shù)指導(dǎo)》） (第11版），俄勒閃州尤金市：2010。將多種染料連接至相同蛋白質(zhì)通常稱作'共染色'。共 染可通過(guò)，使染料與蛋白質(zhì)在不同的條件下反應(yīng)等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，丹磺酰-X琥珀酰亞 胺基酯與合適的氨基酸側(cè)鏈在25-37Γ和pH 7. 5-8. 5下發(fā)生最適反應(yīng)，而單藍(lán)A的乙烯砜 基團(tuán)在60°C和pH 9-10下發(fā)生最適反應(yīng)。通過(guò)改變溫度和pH，可依次進(jìn)行所述反應(yīng)。
[0049] 或者，所述可檢測(cè)的部分可以是多肽。所述多肽可以是所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)的多肽 鏈的部分。采用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)，可使多肽序列在所述多肽鏈的N-或C-末端或他處納入 已有的蛋白質(zhì)。這些技術(shù)可參見(jiàn) Sambrook 和 Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》）（第三版），紐約：冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2001及他處。所述多肽還可經(jīng)化學(xué)合成并通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑連 接至蛋白質(zhì)。例如，所述肽可用EMCS(6-馬來(lái)酰亞胺己酸N-琥珀酰亞胺基酯）在N-末端 活化，使其能夠與游離半胱氨酸殘基反應(yīng)。
[0050] 在一些實(shí)施方式中，所述多肽可包含能以高親和性和特異性被結(jié)合伴侶識(shí)別的氨 基酸序列。所述序列在本文中稱為識(shí)別序列?？衫绮捎秒娪緛?lái)檢測(cè)包含識(shí)別序列的多肽 部分。如本領(lǐng)域熟知，電泳涉及在電泳凝膠經(jīng)過(guò)跑動(dòng)之后，利用與凝膠跑動(dòng)的電場(chǎng)相垂直的 電場(chǎng)，將蛋白質(zhì)從所述凝膠轉(zhuǎn)移出去。將經(jīng)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)沉積在膜（也稱作'印跡'或'印 跡膜通常由硝化纖維素或聚偏二氟乙烯（PVDF)制成）的表面上，然后使該膜在包含所述 結(jié)合伴侶的溶液中孵育。所述部分與結(jié)合伴侶之間的結(jié)合可通過(guò)光學(xué)方法檢測(cè)，例如采用 熒光或化學(xué)發(fā)光法，利用放射性或本領(lǐng)域已知的其它方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0051] 如果識(shí)別序列以抗體作為其結(jié)合伴侶，那么所述識(shí)別序列被稱為抗體結(jié)合表位或 簡(jiǎn)單地稱為表位。生物技術(shù)中常用的表位的示例有：FLAG和myc表位。沉積在印跡上的蛋 白質(zhì)可在稱為Western印跡的熟知技術(shù)中，利用針對(duì)所述蛋白質(zhì)的表位的抗體來(lái)檢測(cè)。檢 測(cè)可通過(guò)例如如下方式來(lái)完成：將熒光標(biāo)記物偶聯(lián)至所述抗體，用合適波長(zhǎng)的光照射所述 印跡，并觀察由所述標(biāo)記物重新發(fā)出的光。作為所述標(biāo)記物的替代，可使合適的酶或化學(xué)結(jié) 構(gòu)偶聯(lián)至所述抗體，以誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光。所述結(jié)構(gòu)的一個(gè)示例是辣根過(guò)氧化物酶（HRP)，其在 過(guò)氧化氫的存在下催化魯米諾氧化成3-氨基鄰苯二甲酸酯，由此發(fā)出可見(jiàn)光。所述抗體可 以替代性地納入放射性同位素（例如 35S)，然后采用蓋革（Geiger)計(jì)數(shù)器或?qū)υ撏凰氐?衰減敏感的膠片來(lái)檢測(cè)。
[0052] 作為直接檢測(cè)與所述表位結(jié)合的抗體的替代，可采用二抗。二抗對(duì)結(jié)合該表位的 抗體（本領(lǐng)域稱為'一抗'）具有特異性，并且可偶聯(lián)至熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光催化劑或如上 所述的其它檢測(cè)工具。在將印跡與一抗孵育之后，可使該印跡與二抗孵育，然后可檢測(cè)包含 與結(jié)合至所述表位的一抗結(jié)合的二抗的'夾心'復(fù)合體。在一些情況下，可使所述印跡上結(jié) 合的抗體脫除，以允許采用不同的抗體組檢測(cè)所述印跡上的蛋白質(zhì)。
[0053] 或者，所述識(shí)別序列可結(jié)合非抗體蛋白質(zhì)，或其可結(jié)合小分子。在該情況中，所述 識(shí)別序列可稱為親和標(biāo)簽（盡管術(shù)語(yǔ)'表位'和'親和標(biāo)簽'有時(shí)在本領(lǐng)域中可互換使用）。 親和標(biāo)簽的示例有：STPl (氨基酸序列WTHPQFER，SEQ ID NO:l)、Str印-標(biāo)簽1(氨基酸序列 AWRHPQFGG，SEQ ID N0:2)，和Str印-標(biāo)簽 11(氨基酸序列WSHPQFEK，SEQ ID N0:3)(通稱為 Str印-標(biāo)簽'），其結(jié)合蛋白質(zhì)鏈霉親和素及其工程改造的突變體（稱作Str印-Tactin (參 見(jiàn)例如，Schmidt等，J. Mol. Biol. 255, 753-766,1996))。所述STPl標(biāo)簽缺乏賴氨酸或半胱 氨酸殘基，其在蛋白質(zhì)標(biāo)記中通常用作染料的連接位點(diǎn)。因此，所述標(biāo)簽在多種染料-標(biāo)記 反應(yīng)中不經(jīng)歷共價(jià)修飾，并保留其對(duì)于其結(jié)合伴侶的親和性。因此，所述STPl標(biāo)簽可用于 在電印跡之后檢測(cè)印跡上的染料-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。像抗體一樣（上文描述），可使親和標(biāo)簽 的結(jié)合伴侶偶聯(lián)至合適的分子檢測(cè)工具。
[0054] 本文還提供蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，其中至少一種蛋白質(zhì)包含Strep-標(biāo)簽（例如STPl)。 所述蛋白質(zhì)可以，但不必需，包含共價(jià)連接的染料或其它標(biāo)記物，如上所述。當(dāng)不需要對(duì)電 泳凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，但需要檢測(cè)印跡時(shí)，此類實(shí)施方式是有用的。所述標(biāo)準(zhǔn)品 的至少一個(gè)蛋白質(zhì)組中不存在標(biāo)記物簡(jiǎn)化了所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備，并可降低所述組中蛋白質(zhì) 分子量的異質(zhì)性。這允許在所述印跡上以更大的準(zhǔn)確性估計(jì)還包含Str印-標(biāo)簽的樣品蛋 白質(zhì)的分子量。
[0055] 在本發(fā)明的包含標(biāo)記的蛋白質(zhì)的實(shí)施方式中，其中所述標(biāo)記物或部分是卟啉，必 要時(shí)可檢測(cè)所述卟啉，包括但不限于在電印跡之后通過(guò)化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。如上所述，金屬 離子可在卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的中心處配位。金屬離子，例如鐵，催化魯米諾氧化，并在結(jié)合至卟啉 時(shí)進(jìn)行所述催化。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用氯高鐵血紅素（與鐵結(jié)合的原卟啉IX)標(biāo)記的蛋白質(zhì)可 在將所述印跡暴露至魯米諾和過(guò)氧化氫之后在該印跡上檢測(cè)。
[0056] 所述標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)組可單獨(dú)且獨(dú)立地制備，然后合并。因此，包含本文所述的任 何具體要素（例如色氨酸殘基、標(biāo)記物或可檢測(cè)部分）的蛋白質(zhì)組的數(shù)量可按實(shí)踐者的需 要而變化。若所述要素存在于至少一個(gè)蛋白質(zhì)組中，那么該數(shù)量的范圍可以是，例如，1~ 10或至多為所述標(biāo)準(zhǔn)品中蛋白質(zhì)組的總數(shù)。包含標(biāo)記的和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)的混合物的蛋白 質(zhì)組的數(shù)量可類似地變化。
[0057] 在一些方面中，使所述標(biāo)準(zhǔn)品的不同的蛋白質(zhì)組具有不同的特征可以是有利的。 例如，一組的蛋白質(zhì)可具有紅色標(biāo)記物，而不同組的蛋白質(zhì)可具有藍(lán)色標(biāo)記物。不同的顏色 允許通過(guò)肉眼簡(jiǎn)易地鑒定對(duì)應(yīng)于這些蛋白質(zhì)組的條帶，允許實(shí)踐者在凝膠跑動(dòng)時(shí)度量蛋白 質(zhì)迀移的進(jìn)度，并在操作時(shí)確定所述凝膠的'方向'。因此，在一些實(shí)施方式中，一個(gè)蛋白質(zhì) 組中的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物與另一不同的蛋白質(zhì)組中的蛋白質(zhì)的標(biāo)記物在光譜上不同。所述光 譜差異也可應(yīng)用到熒光標(biāo)記物上：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中標(biāo)志物的差異性允許對(duì)伴隨所述標(biāo)準(zhǔn)品 在凝膠中跑動(dòng)的寬范圍的熒光樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行表征，因?yàn)榭梢愿嗟陌l(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)所述標(biāo) 準(zhǔn)品?；谙嗤?，還可有利地配制具有不同表位或親和標(biāo)簽的所述標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)組， 以允許采用更大范圍的結(jié)合伴侶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)配和樣品蛋白質(zhì)。
[0058] 所述標(biāo)準(zhǔn)品的不同的蛋白質(zhì)組對(duì)應(yīng)于不同的分子量。例如，一個(gè)組可包含約50kDa 的蛋白質(zhì)，而另一組可包含約200kDa的蛋白質(zhì)。組內(nèi)的蛋白質(zhì)的重量可能不同，這歸因于， 例如，如上所述的分子異質(zhì)性的非均一標(biāo)記來(lái)源或其它來(lái)源。然而，在一些實(shí)施方式中，組 內(nèi)蛋白質(zhì)之間的重量差異遠(yuǎn)小于不同組的蛋白質(zhì)之間的這一差異。在一些實(shí)施方式中，所 述標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)組的分子量差異為至少1、2、5、10、20、50或lOOkDa。在一些實(shí)施方式中， 蛋白質(zhì)組對(duì)應(yīng)于10~250kDa范圍內(nèi)的分子量。
[0059] 具有多個(gè)蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品通常包含多個(gè)氨基酸序列。來(lái)自兩組的蛋白質(zhì) 通常具有不同的氨基酸序列，盡管它們還可通過(guò)共價(jià)修飾來(lái)彼此區(qū)分。使所述標(biāo)準(zhǔn)品的不 同的蛋白質(zhì)組具有不同的可檢測(cè)特征的另一個(gè)益處在于，這些特征可根據(jù)各組中存在的氨 基酸序列而特定。例如，熒光標(biāo)記物可僅存在于一組中，因?yàn)橄嚓P(guān)的標(biāo)記化學(xué)法僅適于該組 中蛋白質(zhì)的氨基酸序列。不意在限制可用于所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的總體氨基酸序列，各組的 蛋白質(zhì)可包含一種氨基酸序列或多于一種氨基酸序列。所述標(biāo)準(zhǔn)品中所用的氨基酸序列可 以是天然形成或經(jīng)工程改造的?？捎糜诘鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品中的天然形成從蛋白質(zhì)的示例可見(jiàn)于 Weber 和 Osborn，J. Biol. Chem. 244,4406-4412,1969,以及他處。
[0060] 蛋白質(zhì)標(biāo)記以及標(biāo)記的和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)的混合的化學(xué)計(jì)量法，如上所述，涉及 必需上樣進(jìn)入電泳凝膠以獲得所需光學(xué)信號(hào)水平的蛋白質(zhì)濃度。在一個(gè)蛋白質(zhì)組的制備 中，在其它條件等同的情況下，降低標(biāo)記的化學(xué)計(jì)量學(xué)，或減少混合物中標(biāo)記的蛋白質(zhì)相對(duì) 于未標(biāo)記的蛋白質(zhì)的量，能夠減少每個(gè)蛋白質(zhì)分子的標(biāo)記物平均數(shù)量。較少的標(biāo)記物/分 子意味著必需采用更大質(zhì)量的所述蛋白質(zhì)組加樣，以檢測(cè)所述標(biāo)記物。這對(duì)于本文設(shè)想的 各種標(biāo)記物均是如此；考慮每個(gè)分子的鹵烷基