一種基于適配體識(shí)別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)食品中沙門氏菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于適配體識(shí)別表面增強(qiáng)拉曼光譜 檢測(cè)食品中沙門氏菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門氏菌屬于一種腸道桿菌致病菌，革蘭氏陰性。沙門氏菌在自然界中廣泛存在， 特別容易污染水源、食品及畜產(chǎn)品，對(duì)于人類和動(dòng)物的健康均構(gòu)成極大危害。人或動(dòng)物食用 了被沙門氏菌污染的食品即會(huì)引發(fā)食物中毒。沙門氏菌引起的急性傳染病，臨床表現(xiàn)主要 分為胃腸炎型（即食物中毒）、傷寒型、敗血癥型及腸道外局灶性感染。其中以胃腸炎型最 為常見，可引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉及發(fā)熱等臨床征候群。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)細(xì)菌性食 物中毒中，70%~80%是由沙門氏菌引起的，世界各地的食物中毒中，美國(guó)、中國(guó)沙門氏菌 食物中毒居首位。由此可見沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上最為主要的人畜共患病之一。因此 建立準(zhǔn)確、靈敏、快速的沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)對(duì)于食品安全具有重要意義。
[0003] 傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)程序繁瑣復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性在很大 程度上依賴于檢測(cè)者的專業(yè)素質(zhì)和經(jīng)驗(yàn)，所以該方法不夠客觀、靈敏、快速；新發(fā)展起來的 熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，雖然能縮短檢驗(yàn)時(shí)間，特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是費(fèi)用昂貴、易污 染，對(duì)操作環(huán)境要求高；現(xiàn)今常用的免疫學(xué)方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫 吸附、免疫磁性分離技術(shù)，免疫熒光標(biāo)記等，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，但 制備抗體的時(shí)間比較長(zhǎng)，成本高，且不穩(wěn)定。近些年來，由于適配體（aptamer)較之抗體有 諸多優(yōu)點(diǎn)：成本低，穩(wěn)定性好，易于修飾等等，因此被作為抗體分子的前景性替代分子，受到 很多領(lǐng)域的關(guān)注。
[0004] 拉曼散射由于蘊(yùn)含分子振轉(zhuǎn)能級(jí)的豐富信息，已成為物質(zhì)分析的有力工具，特別 是表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)技術(shù)的出現(xiàn)，使其檢測(cè)靈敏度獲得了極大的提高。近年來， SERS光譜以其高分辨率、高靈敏度、溶液干擾性小、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于物理、材 料、表面科學(xué)、環(huán)境化學(xué)、生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)甚至生物學(xué)的分析和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種基于適配體識(shí)別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)食品中沙門氏 菌的方法。本發(fā)明采用銀包覆金的核殼型納米材料作為基底，將巰基化修飾的沙門氏菌適 配體加入到上述制備所得的銀包覆金的核殼型納米材料中孵育，從而將沙門氏菌適配體固 定在基底上。將被測(cè)物與修飾有沙門氏菌適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加入 具有拉曼信號(hào)R0X修飾的沙門氏菌適配體進(jìn)行孵育，然后進(jìn)行拉曼光譜掃描?；谶m配體 與沙門氏菌的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中沙門氏菌的檢測(cè)。具體檢測(cè)示意圖如圖1所示。本 方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方便，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。
[0006] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方法： 一種基于適配體識(shí)別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)食品中沙門氏菌的方法，包括以下步驟： 1) 拉曼增強(qiáng)基底的合成：采用檸檬酸三鈉還原法首先制備得到納米金，然后加入一定 量的抗壞血酸和硝酸銀，制備得到銀包覆金的核殼型納米材料基底。 2) 適配體的固定化：將一定量巰基化修飾的適配體加入到上述制備所得的銀包覆金 的核殼型納米材料中孵育，從而將適配體固定在基底上。 3) 沙門氏菌的檢測(cè)：將待測(cè)液與修飾有適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加 入一定量的具有拉曼信號(hào)ROX修飾的適配體，然后進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。
[0007] 具體的：步驟1)所述拉曼增強(qiáng)基底的合成具體操作為，取0. 5mL 1 %的氯金酸溶 液，加入到49. 5mL超純水中，加熱并攪拌，至沸騰；然后迅速加入1. 5mL 1 %的檸檬酸三鈉 溶液，持續(xù)煮沸15min，合成納米金顆粒。接著取制備好的納米金2mL，加入lmL超純水， 0. 4mL L-抗壞血酸（0. lmol/L)，持續(xù)攪拌5min，逐滴加入1. 2mL硝酸銀（1 X 10 3mol/L)，持 續(xù)攪拌1小時(shí)，制備得到銀包覆金的核殼型納米材料。
[0008] 步驟2)所述的適配體固定化操作為，取銀包覆金核殼型納米顆粒190 iiL，加入 10yL適配體（10ymol/L)，4°C孵育12小時(shí)。
[0009] 步驟3)所述的檢測(cè)，不同濃度的沙門氏菌樣品與適配體修飾的銀包覆金核殼型 納米材料于室溫下孵育45min，然后加入R0X修飾的適配體繼續(xù)孵育45min。之后于3000r/ min離心5min，并清洗兩次。樣品重懸于緩沖液中上拉曼光譜儀檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1. 本發(fā)明方法以適配體作為識(shí)別元件，相比于免疫分析法中使用抗體作為識(shí)別元件， 適配體穩(wěn)定性好，制備成本低，易于標(biāo)記且標(biāo)記后不影響其活性，同時(shí)對(duì)目標(biāo)菌體具有高度 親和力和高度選擇性，在很大程度上提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。 2. 本發(fā)明以銀包覆金的核殼型納米復(fù)合材料作為拉曼增強(qiáng)基底，具有貴金屬的光譜特 性，且試樣制備快速，成本低等優(yōu)點(diǎn)。 3. 本發(fā)明中提供的檢測(cè)方法與現(xiàn)有沙門氏菌的檢測(cè)方法相比，具有靈敏度高的特點(diǎn)， 其檢測(cè)限可達(dá)到17cfu/mL。
【附圖說明】
[0011] 圖1基于適配體識(shí)別表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)沙門氏菌的示意圖 圖2銀包覆金核殼型納米粒子的透射電子顯微鏡圖（TEM) 圖3不同濃度的沙門氏菌引起的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖（A)，相對(duì)拉曼強(qiáng)度與沙門氏菌 濃度的線性關(guān)系圖（B)
【具體實(shí)施方式】
[0012] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0013] 實(shí)施例1 1)拉曼增強(qiáng)基底的合成 首先取0. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的氯金酸溶液于100mL圓底燒瓶中，加入超純水49. 5mL，加 熱并攪拌，至沸騰；然后迅速加入1. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)煮沸15min 后，溶液顏色變?yōu)榫萍t色，停止反應(yīng)，自然冷卻至室溫。接著取制備好的納米金2mL于50mL 圓底燒瓶中，加入lmL超純水，0. 4mL L-抗壞血酸（0. lmol/L)，室溫下持續(xù)攪拌5min，然后 逐滴加入1. 2mL硝酸銀（1 X 10 3m〇l/L)，持續(xù)攪拌1小時(shí)，溶液由酒紅色變?yōu)槌赛S色，終止 反應(yīng)，所得溶液為拉曼增強(qiáng)基底-銀包覆金核殼型納米顆粒。圖2為銀包覆金核殼型納米 顆粒的透射電子顯微鏡圖（TEM)