，從圖中可以看出，納米顆粒的粒徑為20nm左右，銀殼的厚 度約為4nm〇 2) 適配體的固定化 取銀包覆金核殼型納米顆粒190 y L，加10 y L適配體（10 y mol/L)，使適配體最終濃度 為500nmol/L，置于4°C搖床中，75r/min，孵育12h。以12000r/min離心15min，棄上清，并 用PBS緩沖液清洗2次，重懸于100 y L PBS緩沖液中備用。 3) 緩沖液中沙門氏菌的檢測 以平板計(jì)數(shù)法得到濃度為1. 7 X 107cfu/mL的沙門氏菌菌液，再將該菌液梯度稀釋至 1. 7X 106cfu/mL，1. 7X 105cfu/mL，1. 7X 104cfu/mL，1. 7X 103cfu/mL，1. 7X 102cfu/mL ;以步 驟2)合成的適配體修飾的銀包覆金的復(fù)合材料作為拉曼增強(qiáng)試劑與捕獲探針，取該復(fù)合 物175yL與10yL的待測樣品混合于37°C孵育45min。然后加入15yL(10ymol/L)修 飾有R0X信號分子的適配體，于37°C孵育45min。之后于3000r/min離心5min，并清洗兩 次。樣品重懸與緩沖液中上拉曼光譜儀檢測。圖3A所示為濃度范圍在17~1.7 X105cfu/ mL沙門氏菌引起的拉曼光譜圖。由圖可見，隨著沙門氏菌濃度的增加，拉曼強(qiáng)度也相應(yīng) 增高。以1628cm 1為定量特征峰，圖3B所示為沙門氏菌線性曲線圖。沙門氏菌在17~ 1. 7 X 105cfu/mL濃度范圍內(nèi)，與1628cm 1處相對拉曼強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y =580. 29x-737. 59 (R = 0? 9925)，最低檢出限為 17cfu/mL。
[0014] 實(shí)施例2 1) 拉曼增強(qiáng)基底的合成 首先取0. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的氯金酸溶液于100mL圓底燒瓶中，加入超純水49. 5mL，加 熱并攪拌，至沸騰；然后迅速加入1. 5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的檸檬酸三鈉溶液，持續(xù)煮沸15min 后，溶液顏色變?yōu)榫萍t色，停止反應(yīng)，自然冷卻至室溫。接著取制備好的納米金2mL于50mL 圓底燒瓶中，加入lmL超純水，0. 4mL L-抗壞血酸（0. lmol/L)，室溫下持續(xù)攪拌5min，然后 逐滴加入1. 2mL硝酸銀（1 X 10 3m〇l/L)，持續(xù)攪拌1小時(shí)，溶液由酒紅色變?yōu)槌赛S色，終止 反應(yīng)，所得溶液為拉曼增強(qiáng)基底-銀包覆金核殼型納米顆粒。圖1為銀包覆金核殼型納米 顆粒的透射電子顯微鏡圖（TEM)，從圖中可以看出，納米顆粒的粒徑為20nm左右，銀的厚度 約為4nm。 2) 適配體的固定化 取銀包覆金核殼型納米顆粒190 y L，加10 y L適配體（10 y mol/L)，使適配體最終濃度 為500nmol/L，置于4°C搖床中，75r/min，孵育12h。以12000r/min離心15min，棄上清，并 用PBS緩沖液清洗2次，重懸于100 y L PBS緩沖液中。 3) 牛奶中沙門氏菌的檢測 牛奶作為實(shí)際樣品；取5mL牛奶，在10°C下7000r/min離心10min，完全去除上層脂肪 層。將得到的樣本用去離子水1 :20稀釋，再經(jīng)過一次性注射式濾器過濾，最終得到待測溶 液，配制不同濃度的沙門氏菌加入待測溶液中。用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測，并計(jì)算回收率，結(jié) 果如表1所示。 表1本發(fā)明方法檢測牛奶中沙門氏菌的結(jié)果
[0015] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明的涵蓋范圍。 序列表 (110)江南大學(xué) (120) 一種基于適配體識別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌的方法 (130) (160) 1 (170) Patentln version 3.5 (210)1〈211〉 40 (212) ：DNA (213) 人工序列 M()0V 1 agtaatgccc ggtagttatt eaaagatgag taggaaaaga 40
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于適配體識別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌的方法。其特征在于： 采用銀包覆金的核殼型納米材料作為基底，將疏基化修飾的沙門氏菌適配體加入到上述制 備所得的銀包覆金的核殼型納米材料中孵育，從而將沙門氏菌適配體固定在基底上。將被 測物與修飾有沙門氏菌適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加入具有拉曼信號ROX 修飾的沙門氏菌適配體進(jìn)行孵育，然后進(jìn)行拉曼光譜檢測。在一定濃度范圍內(nèi)，沙門氏菌的 數(shù)量與拉曼信號強(qiáng)度呈正相關(guān)，以達(dá)到對沙門氏菌定量檢測的目的。2. 如權(quán)利要求1所述的一種基于適配體識別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌 的方法，其特征在于：采用檸檬酸三鈉還原法首先制備得到納米金，然后加入一定量的抗壞 血酸和硝酸銀，制備得到銀包覆金的核殼型納米材料基底。3. 如權(quán)利要求1所述的一種基于適配體識別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌 的方法，其特征在于：巰基化修飾的沙門氏菌適配體序列為5' -SH-AGTAATGCCCGGTAG TTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3'，具有拉曼信號ROX修飾的沙門氏菌適配體序列 為 5' -ROX-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3'。4. 如權(quán)利要求1所述的一種基于適配體識別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌 的方法，其特征在于：在一定濃度范圍內(nèi)，沙門氏菌的數(shù)量與拉曼光譜信號強(qiáng)度呈正相關(guān)， 對照1628cm1的發(fā)光峰信號強(qiáng)度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于適配體識別表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測食品中沙門氏菌的方法。采用銀包覆金的核殼型納米材料作為基底，將巰基化修飾的沙門氏菌適配體加入到上述制備所得的銀包覆金的核殼型納米材料中孵育，從而將沙門氏菌適配體固定在基底上。將被測物與修飾有沙門氏菌適配體的銀包覆金的核殼型納米材料混合，加入具有拉曼信號ROX修飾的沙門氏菌適配體進(jìn)行孵育，然后進(jìn)行拉曼光譜掃描?；谶m配體與沙門氏菌的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對食品中沙門氏菌的檢測。本方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方便，在食品安全檢測領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N21/65
【公開號】CN105203524
【申請?zhí)枴緾N201510632911
【發(fā)明人】段諾, 張輝, 吳世嘉, 戴邵亮, 王周平
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月29日