一種適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法
【技術(shù)領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白組學研究領域的一種紅樹植物蛋白提取與分離方法，具體涉及一 種穩(wěn)定、高效的適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 紅樹林是生長在熱帶、亞熱帶海灣、河口泥灘上特有的以紅樹植物為主體的常綠 灌木或喬木組成的海洋濕地生物群落，是重要的海洋濕地生態(tài)系統(tǒng)。紅樹林在防風消浪、護 堤固岸、促淤固灘、凈化水體和維持沿海濕地生物多樣性等方面具有重要作用和巨大的社 會經(jīng)濟效益。目前，全球極端天氣氣候?qū)t樹林的生存和發(fā)展產(chǎn)生了直接的影響，秋茄，作 為紅樹植物的常見物種，是抗寒性最強、分布最廣的紅樹物種之一，如何從蛋白質(zhì)水平上研 究紅樹植物秋茄對逆境的響應與適應機制對應對全球變化具有重要科學意義。
[0003] 雙向電泳是在蛋白水平上研究復雜基因表達非常有效的方法，為了獲得好的結(jié) 果，高質(zhì)量的蛋白樣品制備是蛋白組學研究中最重要的步驟之一。然而，蛋白樣品提取過程 中經(jīng)常會發(fā)生共沉淀或其他非蛋白物質(zhì)的污染。由于紅樹植物中常含有大量的其他物質(zhì)， 如單寧、鹽分、色素、多糖、多酸、脂類、淀粉、蛋白酶、細胞壁、液泡和其他刺激代謝產(chǎn)物等， 嚴重地影響了蛋白質(zhì)的提取分離，并且紅樹植物中蛋白的含量相對較低，使蛋白的提取變 得更加困難。秋茄葉片組織中的這些干擾物質(zhì)含量非常高，使得秋茄葉片蛋白的提取尤其 困難，如何獲得高質(zhì)量的蛋白對于秋茄蛋白組學的研究顯得至關重要。
[0004] 三氯乙酸-丙酮沉淀法（簡稱TCA-A法）是開展絕大多數(shù)植物蛋白組學研究最 基本的方法。TCA-A法已經(jīng)成功用于不同的植物組織蛋白提取，如木材組織、玉米葉片等。 盡管TCA-A法可以增強蛋白的共沉淀作用，并有助于去除雜質(zhì)，然而一些聚合物雜質(zhì)也常 常一起被共沉淀；此外，TCA-A法的另外一個缺點就是蛋白被TCA-A沉淀后，蛋白不能完 全再溶解。在秋茄葉片蛋白組學研究中，TCA-A法提取的蛋白在雙向電泳圖上顯示出了 明顯的縱條紋和拖尾現(xiàn)象。蛋白提取的另一個常用基本方法就是苯酚提取法（簡稱Phe 法）。Phe法可以追溯到19世紀50年代。在一些植物蛋白提取中，苯酚被發(fā)現(xiàn)是一個能 將蛋白從水溶液中提取的有效試劑。然而，以往的研究表明，Phe法仍然不能很好地將干 擾物質(zhì)從紅樹植物中去除，如秋前（Kandeliacandel) (Wang,L.G.，Liu,X.，Liang,M.，et al.Proteomicanalysisofsalt-responsiveproteinsintheleavesofmangrove Kandeliacandelduringshort-termstress.PlosOne, 2014b,9(1) :e83141. D01:10. 1371/journal.pone. 0083141)、木欖（Zhu，Z.，Chen，J.，Zheng，H.L.Physiological andproteomiccharacterizationofsalttoleranceinamangroveplant，Bruguiera gymnorrhiza(L·)Lam.TreePhysiology，2012, 32(11) : 1378-1388.)和紅海欖（吉星，鄧用 川，黃惜等.紅海欖根部鹽脅迫反應的比較蛋白質(zhì)組學分析.中國生物化學與分子生物學 報，2009, 25(1) :72-77.)等。以往研究中用Phe法獲得的蛋白進行的雙向電泳圖譜中，存 在著高背景值，這表明還是有很多干擾雜質(zhì)的存在。目前，有關雙向電泳在紅樹植物中的應 用報道還較少，尤其在紅樹植物蛋白組學研究中還沒有很好的蛋白提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、高效適用于雙向電泳的秋茄葉片總蛋白的提取方 法，本方法操作簡便、蛋白提取效率高、分離蛋白點多、雜質(zhì)少、重復性好、圖譜清晰、不干擾 第一向等電聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳，是一套適用于秋茄葉片總蛋白的提取的有 效方法。
[0006] 本發(fā)明的適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法，其特征在于，包括 以下步驟：
[0007] (1)、取新鮮秋茄葉片剪碎后，每lg樣品加入0.lg的PVPP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷 酮），于研缽中用液氮充分研磨，將研好的粉末轉(zhuǎn)移至預冷的離心管中；
[0008](2)、用TCA/丙酮對步驟⑴離心管中的粉末進行洗滌，每lg樣品加入5ml預冷 的含質(zhì)量體積比為10%TCA的丙酮，渦旋，充分震蕩后離心，棄上清；
[0009] (3)、用含有0. 1M醋酸銨的體積分數(shù)為80 %甲醇進行洗滌，充分混勻，使溶液pH值 達到7以上，離心后去除上清；
[0010] (4)、加入體積分數(shù)為80%丙酮進行洗滌，充分渦旋后直到沉淀完全懸浮，離心后 去除上清；
[0011] (5)、將沉淀真空干燥，以去除殘留的丙酮；
[0012] (6)、提取并沉淀蛋白：每lg樣品加入8ml體積比為1:1的苯酌VSDS(十二烷基橫 酸鈉）緩沖液，其中，苯酚的pH值大于（或等于）7. 8,充分混勻并孵育，離心，將上層酚相轉(zhuǎn) 移到新的離心管，加入5倍體積的含有0. 1M醋酸銨的甲醇，沉淀過夜，離心后棄上清，留沉 淀；
[0013](7)、用甲醇洗滌步驟(6)的沉淀一次，再用體積分數(shù)為80%丙酮和純丙酮各洗滌 一次，在每一次洗滌步驟中，都要充分渦旋混勻，然后離心棄上清，留沉淀；
[0014] (8)、吸干剩余的液體，并將沉淀攤開，真空干燥，得到蛋白干粉；
[0015] (9)、將步驟⑶得到的蛋白干粉保存?zhèn)溆没蜻M行蛋白裂解：向蛋白干粉中按 20μΙ/mg加入樣品裂解液，使蛋白干粉充分浸潤、混勻，孵育，期間不時地顛倒混勻，蛋白質(zhì) 充分溶解，離心后所得的上清即為適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白。
[0016] 步驟（6)所述的SDS緩沖液，優(yōu)選，其配方為：30% (w/v)蔗糖，2% (w/v)SDS，0· 1M Tris-HCl(pH8. 0)，5% (ν/ν)β-巰基乙醇，ImMPMSF(苯甲基磺酞氟）。
[0017] 步驟（6)所述的沉淀過夜，優(yōu)選，溫度為-20°C。
[0018] 步驟（9)所述的樣品裂解液，優(yōu)選，其配方為：7M尿素，2M硫脲，4% (w/v)CHAPS(3 一 [(3-膽酞胺丙基）一二乙胺]一丙磺酸），0· 2% (v/v)pH值為4-7的兩性電解液，50mM DTT(二硫蘇糖醇），2mMTBP(磷酸三丁酯），0.ImMPMSF。
[0019] 步驟（9)所述的孵育，優(yōu)選在35°C下孵育2h。
[0020] 所述的兩性電解液，優(yōu)選為IPGbuffer。
[0021] 通過以上步驟制備得到的紅樹植物秋茄葉片總蛋白可直接用于蛋白質(zhì)定量 (Bradford法）或雙向電泳分析或分裝后存于-80 °C備用。
[0022] 本發(fā)明的技術(shù)效果：
[0023] (1)、在研磨樣品的過程中加入適量的PVPP，有效增強了植物組織中多酚的去除；
[0024](2)、用含10%TCA的丙酮快速洗滌研磨后的植物粉末，有效增強了蛋白的沉淀作 用和雜質(zhì)的去除（主要是脂類或類脂多聚物、酚類物），同時避免了蛋白長時間暴露低pH環(huán) 境（含TCA)下，減少了由此而引起的蛋白降解和修飾；
[0025] (3)、用含10%TCA的丙酮洗完后增加了用含0. 1M醋酸銨的80%甲醇洗滌步驟， 這一步驟能有效地中和殘余的TCA，使pH值增加至7以上，從而增強了后續(xù)苯酚對蛋白分離 提取的效率；
[0026] (4)、苯酚與SDS溶液混合后作為提取蛋白的溶劑，不僅能有效去除蛋白中的鹽 類、酸性雜質(zhì)，還有效地增強了蛋白的溶解性，其中SDS是膜結(jié)合蛋白恢復非常有效的助溶 劑；
[0027](5)、本發(fā)明通過聯(lián)合傳統(tǒng)提取蛋白的三氯乙酸/丙酮沉淀法和苯酚抽提法，同時 引入助溶劑SDS溶液，并優(yōu)化提取過程，建立了一種適合紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取的 Phe-B方法；本發(fā)明有效地提高了蛋白質(zhì)的提取效率和質(zhì)量，其技術(shù)方案可專門適合于雙 向電泳的秋茄葉片蛋白的提取。本發(fā)明方法具有操作簡單、蛋白提取效率高、干擾物質(zhì)少 的特點，適合于蛋白提取困難、蛋白提取效率低、干擾物質(zhì)多的材料；本發(fā)明所提取的秋茄 葉片蛋白完全滿足雙向電泳第一向和第二向的要求，可獲得分辨率高、蛋白點清晰、數(shù)目較 多、分布均勻、背景清楚的高質(zhì)量雙向電泳凝膠圖譜，且實驗重復性和穩(wěn)定性好。
[0028] 本發(fā)明適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法（Phe-B法）可以 適用于紅樹植物（如秋茄、桐花樹、老鼠簕等）。將本發(fā)明的Phe-B法與其它兩種方 法，Isaacson等人(Isaacson,T. ,Damasceno,C.Μ.Β. ,Saravanan,R.S. ,etal.Sample extractiontechniquesforenhancedproteom