69]
[0070] (2)、從-20°c冰箱取出聚焦好的膠條，先于室溫放置lOmin，使其溶解，將膠條膠 面朝上放置在干的濾紙上，用超純水浸濕過的濾紙輕輕吸去膠面上的礦物油；
[0071] (3)、將已配制好的存于_20°C冰箱的膠條平衡液母液（6M尿素，2%SDS(w/v)， 0.375MTris-HCL(pH8.8),20% (v/v)甘油）取出室溫溶解，現(xiàn)加入2% (w/v)DTT配成膠 條平衡緩沖液I，將聚焦結(jié)束的膠條膠面朝上置膠條平衡緩沖液I緩慢搖動(dòng)14min;
[0072](4)、另取一管已溶解的膠條平衡母液，現(xiàn)加2. 5% (w/v)碘乙酰胺配成膠條平衡 緩沖液II，將第一次平衡結(jié)束的膠條放進(jìn)膠條平衡緩沖液II中，搖床緩慢搖動(dòng)14min;
[0073] (5)、從平衡液中取出的膠條，用濾紙小心吸去膠條表面多余的平衡緩沖液II，用 鑷子夾起膠條的一端，使其完全浸入SDS-PAGE電泳緩沖液工作液中，然后將膠條膠面朝上 放置在長玻璃板上；
[0074] (6)、將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至灌膠架上，短玻璃板一面朝著自己，在凝 膠上方加入已溶解的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液，用鑷子小心由一端慢慢壓向另一端將膠條向下 推入，注意膠條下方不能留有任何氣泡，使膠條與凝膠面緊密接觸，注意不要碰到膠面，濾 紙條上加入蛋白maker，并小心插入膠條的酸性端或堿性端，靜置lOmin至低恪點(diǎn)瓊脂糖徹 底凝固；
[0075] (7)、瓊脂糖封膠液完全凝固后，將固定的凝膠玻璃板，固定在電泳槽 (ProteanII，購自Bio-Rad公司）中，加入一定量的電泳緩沖液工作液，接通電源后，第二向 蛋白電泳開始進(jìn)行，初始電壓5〇V/gel，lh(17Cm)，等到蛋白完全轉(zhuǎn)移出膠條，進(jìn)入凝膠且壓 平至一條線，加大電壓至200V/gel，5. 5h(17cm)，待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部邊緣時(shí)即可 停止電泳。
[0076] 5、考馬斯亮藍(lán)染色
[0077] 電泳結(jié)束后，取出玻璃板，輕輕撬開短玻璃板，取出凝膠，并切角作標(biāo)記（戴手套， 防止污染膠面）進(jìn)行考染。染色步驟如下：
[0078] 染色：將膠放入考染液（0. 2%考馬斯亮藍(lán)R-250,甲醇：乙酸：水=40 :10 :50)輕 輕晃動(dòng)染色30min。
[0079] 脫色：棄去染色液，在脫色液（甲醇：乙酸：水=40 :10 :50)脫色1. 5h，中間每隔 0. 5h換一次脫色液。然后置超純水中脫色1天，間隔換水，去底色。
[0080] 6、凝膠圖像掃描及分析
[0081]經(jīng)過考染的凝膠用掃描儀（GS_800calibratedDensitometer，購自Bio-Rad公 司）掃描，圖像轉(zhuǎn)化成TIFF格式，用ImageMaster2DPlatinum7. 0軟件對(duì)蛋白質(zhì)凝膠圖像 進(jìn)行分析處理。
[0082] 本實(shí)施例中的雙向電泳結(jié)果表明，本發(fā)明的Phe-B法和Phe法得到再溶解的蛋白 點(diǎn)比TCA-A法多，而且條紋拖尾也比TCA-A法少。如圖3所示，Phe-B法和Phe法的2-DE 圖譜上的蛋白點(diǎn)個(gè)數(shù)明顯比點(diǎn)TCA-A法得到的點(diǎn)多。此外，2-DE圖點(diǎn)與點(diǎn)的比較顯示，Phe 法中的幾乎所有蛋白點(diǎn)都被包含在Phe-B法的2-DE蛋白譜圖中。相比Phe法和TCA-A法 而言，Phe-B法得到的蛋白點(diǎn)的數(shù)目是最多的，蛋白帶清晰度和分辨率也是最好的，其次是 Phe法的（如圖2所示），最差的是TCA-A法（如圖1所示）。
[0083] 為了更好地對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，將兩種常用的植物葉片蛋白的提取方法 (TCA-A法和Phe法）與本發(fā)明方法（Phe-B法）的蛋白得率分別進(jìn)行了比較。上述三種方 法提取的秋茄葉片總蛋白的蛋白得率（如圖4所示）結(jié)果顯示，這三種方法提取秋茄葉片 蛋白的產(chǎn)量明顯有差別。本發(fā)明中優(yōu)化建立的Phe-B法提取秋茄葉片蛋白的產(chǎn)量明顯高于 傳統(tǒng)的Phe法和TCA-A法的產(chǎn)量。
[0084] 此外，還對(duì)上述三種方法提取得到的秋茄葉片總蛋白分別進(jìn)行了SDS-PAGE單向 電泳。如圖5所示，結(jié)果顯示這三種蛋白提取方法獲得的蛋白提取物在SDS-PAGE膠上的分 離存在著很大的差異。Phe-B法和Phe法獲得的蛋白提取物比TCA-A法中包含更多的蛋白 多肽。Phe-B法獲得的蛋白條帶分布范圍較寬，從6. 5kDa到116kDa之間，且與TCA-A法和 Phe法比較而言，Phe-B法具有更少的拖尾，背景值也更低。表明Phe-B法方法獲得的蛋白 得到很好的再溶解，且獲得的蛋白提取物所包含的雜質(zhì)也更少。此外，三種方法得到的蛋白 提取物中核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（Rubisco)的豐度也存在著差異，如圖5中的箭頭所 示。Phe-B法所得到的蛋白提取物中Rubisco的含量最低，這樣就有利于植物中其它低豐度 蛋白的分離與分析。
[0085] 本發(fā)明的Phe-B法獲得的蛋白產(chǎn)量最高、在2-DE圖上得到的蛋白點(diǎn)最多，背景雜 質(zhì)、拖尾和條紋最少。本發(fā)明的方法更適合于秋茄葉片總蛋白的提取，對(duì)其它紅樹植物蛋白 質(zhì)的提取都有重要的借鑒意義，可廣泛地應(yīng)用于紅樹植物的蛋白組學(xué)研究中，應(yīng)用前景廣 闊。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 、取新鮮秋茄葉片剪碎后，每Ig樣品加入0.1 g的PVPP，于研缽中用液氮充分研磨， 將研好的粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中； (2) 、用TCA/丙酮對(duì)步驟⑴離心管中的粉末進(jìn)行洗滌，每Ig樣品加入5ml預(yù)冷含質(zhì) 量體積比為10% TCA的丙酮，渦旋，充分震蕩后離心，棄上清； (3) 、用含有0.1 M醋酸銨的體積分?jǐn)?shù)為80 %甲醇進(jìn)行洗滌，充分混勻，使溶液pH值達(dá)到 7以上，離心后去除上清； (4) 、加入體積分?jǐn)?shù)為80%丙酮進(jìn)行洗滌，充分渦旋后直到沉淀完全懸浮，離心后去除 上清； (5) 、將沉淀真空干燥，以去除殘留的丙酮； (6) 、提取并沉淀蛋白：每Ig樣品加入8ml體積比為1:1的苯酚/SDS緩沖液，其中，苯 酚的PH值大于等于7. 8,充分混勻并孵育，離心，將上層酚相轉(zhuǎn)移到新的離心管，加入5倍體 積的含有〇. IM醋酸銨的甲醇，沉淀過夜，離心后棄上清，留沉淀； (7) 、用甲醇洗滌步驟(6)的沉淀一次，再用體積分?jǐn)?shù)為80%丙酮和純丙酮各洗滌一 次，在每一次洗滌步驟中，都要充分渦旋混勻，然后離心棄上清，留沉淀； (8) 、吸干剩余的液體，并將沉淀攤開，真空干燥，得到蛋白干粉； (9) 、將步驟（8)得到的蛋白干粉保存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行蛋白裂解：向蛋白干粉中按20 yl/ mg加入樣品裂解液，使蛋白干粉充分浸潤、混勾，孵育，期間不時(shí)地顛倒混勾，蛋白質(zhì)充分溶 解，離心后所得的上清即為適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法，其特征 在于，步驟（6)所述的SDS緩沖液，其配方為：質(zhì)量體積比為30%的蔗糖，質(zhì)量體積比為2% SDS，0? IM pH值為8. 0的Tris-HCl，體積比為5%的P -巰基乙醇，ImM PMSF。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法，其特征 在于，步驟（6)所述的沉淀過夜，其溫度為-20°C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法，其特征 在于，步驟（9)所述的樣品裂解液，其配方為：7M尿素，2M硫脲，質(zhì)量體積比為4% CHAPS，體 積比為 0. 2% pH 值為 4-7 的兩性電解液，50mM DIT，2mM TBP，0.1 mM PMSF。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法，其特征 在于，步驟（9)所述的孵育，是在35°C下孵育2h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法，其特征 在于，所述的兩性電解液為IPG buffer。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種適合雙向電泳的紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取方法。本發(fā)明通過聯(lián)合傳統(tǒng)蛋白提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法和苯酚抽提法，同時(shí)引入助溶劑SDS溶液，并優(yōu)化提取過程，建立了一種適合紅樹植物秋茄葉片總蛋白提取的Phe-B方法。本發(fā)明有效地提高了蛋白質(zhì)的提取效率和質(zhì)量，其技術(shù)方案可專門適合于雙向電泳的秋茄葉片蛋白的提取。本發(fā)明方法具有操作簡單、蛋白提取效率高、干擾物質(zhì)少的特點(diǎn)，適合于蛋白提取困難、蛋白提取效率低、干擾物質(zhì)多的材料。本發(fā)明所提取的秋茄葉片蛋白完全滿足雙向電泳第一向和第二向的要求，可獲得分辨率高、蛋白點(diǎn)清晰、數(shù)目較多、分布均勻、背景清楚的高質(zhì)量雙向電泳凝膠圖譜，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性好。
【IPC分類】G01N1/28
【公開號(hào)】CN105241720
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510684456
【發(fā)明人】費(fèi)姣, 王友紹, 程皓
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月20日