測定實驗對象組的制作方法
【專利說明】測定實驗對象組
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求2013年1月3日提交的美國臨時申請?zhí)?1/748, 626的權(quán)益，所述申請的 完整內(nèi)容通過引用并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本申請涉及用于使用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測細(xì)胞因子的試劑盒。
[0003] 發(fā)明背景 細(xì)胞因子是介導(dǎo)急性和慢性炎癥反應(yīng)的可溶性因子，并且參與從傷口愈合到自身免疫 性疾病的許多生理事件。它們是細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑，并且它們的差 異表達(dá)已經(jīng)與廣泛范圍的免疫病癥相關(guān)。它們在各種細(xì)胞類型上起作用，對增殖、分化和成 熟具有刺激或抑制作用。因此，測量任何生物系統(tǒng)中的僅單一細(xì)胞因子的水平僅提供了關(guān) 于全身水平的響應(yīng)的部分信息。細(xì)胞因子水平的綜合測試通常目標(biāo)在于測量大組細(xì)胞因子 的濃度，以獲得潛在生理學(xué)的更好的理解。
[0004] 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)是用于定量分泌的細(xì)胞因子的最常用且報道的方法。 然而，ELISA只可以在個別測定孔中檢測每個反應(yīng)一種分析物。這導(dǎo)致高試劑成本，過量的 技術(shù)員時間，并且需要使用大樣品體積來生成每個結(jié)果。經(jīng)由強(qiáng)大的多重測定在相同樣品 中同時檢測和定量許多細(xì)胞因子的能力將降低成本且改善效率。多重技術(shù)相比于常規(guī)測定 方法的優(yōu)點包括同時的分析物檢測、減少的試劑處理、高測定通量和減少的樣品和試劑量。
[0005] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了用于分析細(xì)胞因子實驗對象組的試劑盒，其包含： i. (a)多孔測定板，其包含多個孔，每個孔包含十個離散的結(jié)合域，針對以下人分 析物的捕獲抗體結(jié)合至所述結(jié)合域：IFN-y、IL-Ιβ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-12p70、IL-13、TNFa;(b)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，對于所述人分析物特異性 的標(biāo)記的檢測抗體的集合；和（c)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，校準(zhǔn)蛋白的集合。 ii. (a)多孔測定板，其包含多個孔，每個孔包含十個離散的結(jié)合域，針對以下人分析 物的捕獲抗體結(jié)合至所述結(jié)合域：GM-CSF、IL-1a、IL-5、IL-7、IL-12/IL-23p40、IL-15、 IL-16、IL-17A、TNF-i3、VEGF-A;(b)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，對于所述人分析物 特異性的標(biāo)記的檢測抗體的集合；和（c)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，校準(zhǔn)蛋白的集 合。 iii. (a)多孔測定板，其包含多個孔，每個孔包含十個離散的結(jié)合域，針對以下人分 析物的捕獲抗體結(jié)合至所述結(jié)合域：嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、MIP-α、嗜酸細(xì)胞活化趨化因 子-3、了4此、1?-1〇、]\〇?-10、幾-8、]\〇3-1、]\?(：、]\〇 3-4;〇3)在一個或多個小瓶、容器或隔室 中，對于所述人分析物特異性的標(biāo)記的檢測抗體的集合；和（c)在一個或多個小瓶、容器或 隔室中，校準(zhǔn)蛋白的集合； iv. (a)多孔測定板，其包含多個孔，每個孔包含十個離散的結(jié)合域，針對以下大鼠 分析物的捕獲抗體結(jié)合至所述結(jié)合域：IFN-y、IL-2、IL-4、IL-Ιβ、IL-5、IL-6、KC/GR0、 IL-10、IL-13、TNF-a;(b)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，對于所述人分析物特異性的 標(biāo)記的檢測抗體的集合；和（c)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，校準(zhǔn)蛋白的集合；或 v.(a)多孔測定板，其包含多個孔，每個孔包含十個離散的結(jié)合域，針對以下小鼠分 析物的捕獲抗體結(jié)合至所述結(jié)合域：IFN-y、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GRO、 IL-10、IL-12p70、TNF-a;(b)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，對于所述人分析物特異 性的標(biāo)記的檢測抗體的集合；和（c)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，校準(zhǔn)蛋白的集合。
[0006] 還提供了制造試劑盒或一批試劑盒（諸如本文所述的那些）的方法，其包括： (a)使對于所述人分析物特異性的檢測抗體的初步集合進(jìn)行CIEF、DLS和Experion; (b)基于所述CIEF、DLS和Experion測試從所述檢測抗體的初步集合選擇合格的檢 測抗體；（c)使對于所述人分析物特異性的捕獲抗體的初步集合進(jìn)行CIEF、DLS和 Experion; (d)基于所述CIEF、DLS和Experion測試從所述捕獲抗體的初步集合選 擇合格的捕獲抗體。在一個優(yōu)選實施方案中，一批試劑盒使用該方案制造，并且滿足 以下規(guī)格中的一個或多個：（a)?10%的平均板內(nèi)CV;(b)￡13%的最大板內(nèi)CV;(c) <25%的平均均勾度度量（uniformitymetric) ; (d)<37%的最大均勾度度量；（e) < 18%的板內(nèi)平均值的CV;(f)>1500的信號下限；和（g)〈 106的信號上限。
[0007] 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用于分析兩個或更多個細(xì)胞因子實驗對象 組的試劑盒，其包含：(a)兩個或更多個多孔測定板，每個包含多個孔，每個孔包含十個離 散的結(jié)合域，針對分析物的集合的捕獲抗體結(jié)合至所述結(jié)合域，其中所述分析物的集合選 自： ⑴人分析物：IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13 和TNFa； (ii) 人分析物：GM-CSF、IL-la、IL-5、IL-7、IL-12/IL-23p40、IL-15、IL-16、IL-17A、 TNF-β和VEGF-A; (iii) 人分析物：嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、MIP-1a、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-3、TARC、ΙΡ-10、ΜΙΡ-1β、IL-8、MCP-1、MDC和MCP-4 ; (iv) 大鼠分析物：IFN-y、IL-2、IL-4、IL-1β、IL-5、IL-6、KC/GR0、IL-10、IL-13 和 TNF-a;或 (v) 小鼠分析物：IFN-y、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GR0、IL-10、IL-12p70 和TNF-a; (b)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，對于所述分析物特異性的標(biāo)記的檢測抗體的 集合；和（c)在一個或多個小瓶、容器或隔室中，校準(zhǔn)蛋白的集合。
[0008] 本發(fā)明的一個額外實施方案是10點96孔多孔板，其中每個板包括板頂部、板底 部、板頂部和底部X和y軸，且每個孔包含斑點圖案，其中所述板滿足以下規(guī)格?0.2 mm，Ay￡ 0.2mm，和aΚ〇·Γ，其中（a)Δχ是沿著所述板的χ軸的斑點圖案的中心和 孔的中心之間的差值（difference) ;(b)Ay是沿著所述板的y軸的斑點圖案的中心和孔 的中心之間的差值；且（c)α是板底部的X軸和板頂部的X軸之間的逆時針角。
[0009] 此外，本發(fā)明考慮10點96孔多孔板，其中每個板包含板頂部、板底部，且每個 孔包含斑點圖案，其中所述板滿足以下規(guī)格：（a) 3. 8904-3. 9004英寸的長度范圍；(b) 2. 4736-2. 4836英寸的寬度范圍；和（c) 0. 3513-0. 3573英寸的孔與孔間距。
[0010] 附圖簡述 圖l(a)-(C)說明多孔板的孔中的10點圖案（小圖（a))，其在96孔10點板中的放置 (圖（b))，和使用多孔測定板諸如本文所述的那些進(jìn)行的免疫測定的原理。
[0011] 圖2(a)-(e)是五個細(xì)胞因子實驗對象組中每個的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] 圖3 (a)-(b)顯示96孔多孔測定板的構(gòu)型。
[0013] 發(fā)明詳述 除非本文另有定義，與本發(fā)明結(jié)合使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng) 當(dāng)包括單數(shù)。冠詞"一（a)"和"一（an)"在本文中用于指一個或多于一個（即，至少一個） 冠詞的語法對象。通過實例的方式，"一個要素"意指一個要素或多于一個要素。
[0014]如本文所使用，術(shù)語"樣品"意指任何生物流體、細(xì)胞、組織、器官或其組合或部分， 其包括或可能包括目標(biāo)疾病的生物標(biāo)志物。例如，樣品可以是通過活檢獲得的樣本的組織 切片，或置于或適于組織培養(yǎng)的細(xì)胞。樣品進(jìn)一步可以是亞細(xì)胞級分或提取物，或粗或基本 上純的核酸分子或蛋白制備物。在一個實施方案中，在本發(fā)明的測定中分析的樣品是血液、 外周血單核細(xì)胞（PBMC)、分離的血細(xì)胞、血清和血漿。其他合適的樣品包括活檢組織、腸粘 膜、唾液、腦脊髓液和尿液。
[0015]本發(fā)明涉及用于分析細(xì)胞因子實驗對象組的試劑盒?？紤]至少五個測定實驗對象 組，并且每個試劑盒被配置以分析以下實驗對象組之一： 表1.細(xì)胞因子測定實驗對象組
[0016] 所述試劑盒可以包括（a)多孔板上陣列的單一實驗對象組，其被配置以用于電化 學(xué)發(fā)光測定中，以及（b)相關(guān)耗材，例如，檢測抗體、校準(zhǔn)物和任選的稀釋液和/或緩沖液。 或者，可分開提供多孔板和相關(guān)的耗材。又進(jìn)一步，試劑盒可以包括兩個或更多個具有陣列 在其上的實驗對象組（即，實驗對象組1-5)的多孔板，并且相關(guān)耗材可以在試劑盒中或單 獨提供。
[0017]實驗對象組1、2、4和5包括炎癥相關(guān)的和/或生長因子生物標(biāo)志物，其對于炎癥 反應(yīng)、免疫和許多生物過程的調(diào)節(jié)是重要的。這些分泌的生物標(biāo)志物可以在各種組織和體 液中檢測，并且它們的過表達(dá)或低表達(dá)可以表明機(jī)體的生物平衡的偏移。這些實驗對象組 還由許多Thl/Th2途徑生物標(biāo)志物組成。這些實驗對象組中的生物標(biāo)志物參與多種疾病， 諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏病、哮喘、動脈粥樣硬化、過敏、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肥胖、 癌癥、抑郁、多發(fā)性硬化癥、糖尿病、牛皮癬和克羅恩病等等。
[0018]實驗對象組3由八個CC趨化因子測定（MCP-1、MIP-la、MIP-lb、嗜酸細(xì)胞活化趨 化因子、MCP-4、TARC、MDC和嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-3)和兩個CXC趨化因子測定（IL-8和 IP-10)組成。趨化因子是具有約8-10kDa的分子量的小趨化細(xì)胞因子，其能夠誘導(dǎo)定向 趨化作用。保守位置中的四個半胱氨酸殘基引起其緊湊的三維結(jié)構(gòu)。基于前兩個半胱氨酸 殘基的間隔，它們被分為四個趨化因子的家族-CC趨化因子、CXC趨化因子、C趨化因子和 CX3C趨化因子，其中C代表半胱氨酸，且X代表任何其他氨基酸。趨化因子通過活化特異 性G蛋白偶聯(lián)受體、引起炎性和非炎性細(xì)胞的迀移而發(fā)揮功能。促炎性趨化因子負(fù)責(zé)免疫 細(xì)胞向感染部位的迀移，而穩(wěn)態(tài)趨化因子負(fù)責(zé)目的在于組織維持和發(fā)育的細(xì)胞的迀移。趨 化因子許多疾病相關(guān)。
[0019] 實驗對象組1-5被配置在包括多個孔的多孔測定板中，每個孔具有陣列，所述陣 列具有10個"斑點"或離散的結(jié)合域。10點孔的實例顯示于圖1 (a)，并且該孔并入多孔板 顯示于圖1(b)。將針對每種分析物的捕獲抗體固定在孔中的結(jié)合域上，并且捕獲抗體用于 檢測免疫測定中的目標(biāo)分析物的存在，如圖1(c)中所示。簡而言之，將懷疑含有該分析物 的樣品添加至孔中，并且如果存在，分析物在指定結(jié)合域結(jié)合至捕獲抗體。結(jié)合域上結(jié)合的 分析物的存在通過添加標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行檢測。檢測抗體也結(jié)合至分析物，在結(jié)合域上 形成"夾心"復(fù)合物（捕獲抗體-分析物-檢測抗體）。實驗對象組1-5中的每種分析物 在該10點圖案中的位置被鑒定在表2中。
[0020] 表2.每個實驗對象組的