用于檢測光度測定法的前帶效應(yīng)的方法
【專利說明】用于檢測光度測定法的前帶效應(yīng)的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于通過光度、濁度或比濁免疫測定法組合判斷是否存在前帶效應(yīng)來 測定樣品中特定分析物的量的方法，其中所述特定分析物從所述分析物與分析物特異性測 定試劑相互作用之后反應(yīng)混合物的光信號(hào)變化來定量。
[0002] 均勻免疫測定法的特征在于無分離和洗滌步驟的程序。由于其簡單的一步程序， 成本有效和速度均勻，免疫測定法在臨床實(shí)驗(yàn)室中享受高的知名度，且通常用于高度自動(dòng) 化的臨床化學(xué)分析儀上的臨床診斷。
[0003] 然而，均勻免疫測定法受高劑量Hook效應(yīng)限制，所述Hook效應(yīng)也被稱為前帶效 應(yīng)或抗原過量效應(yīng)，這是其中在高分析物濃度的測定響應(yīng)降低且導(dǎo)致產(chǎn)生分析物的虛低測 量值的現(xiàn)象。該效應(yīng)對(duì)于許多分析物已經(jīng)報(bào)道且影響濁度和比濁測定法以及其它一步免 疫測定法，且由過高濃度的分析物引起，所述過高濃度的分析物飽和抗體的結(jié)合位點(diǎn)，因此 防止形成可檢測的抗體-分析物-抗體復(fù)合物。以該方式，測定響應(yīng)首先隨著抗原濃度遞 增而增加，然后在達(dá)到臨界濃度值之后，測定響應(yīng)降低，得到鐘形曲線，所謂的海德堡曲線 (Heidelbergercurve)。測定法開發(fā)商和制造商通常盡一切努力來減少Hook效應(yīng)，例如通 過增加抗體的量和通過減少分析所需的樣品體積的量?？傊邉┝縣ook效應(yīng)是一步免疫 測定法設(shè)計(jì)固有的現(xiàn)象；在使用洗滌步驟來消除抗原過量的兩步測定形式中，高劑量hook 效應(yīng)得到避免。還可以在使用非基于抗體的結(jié)合劑的其它一步結(jié)合測定法中觀察到前帶效 應(yīng)。
[0004] 臨床化學(xué)中使用的大多數(shù)現(xiàn)代自動(dòng)分析儀已經(jīng)安裝了用于識(shí)別測量樣品中的前 帶效應(yīng)的方法。在樣品顯示前帶效應(yīng)的情況下，所述分析儀標(biāo)記樣品測量。對(duì)于此類標(biāo)記 的測量，根據(jù)儀器設(shè)置，所述分析儀推薦或甚至自動(dòng)進(jìn)行稀釋之后樣品的重新測量。
[0005] 本領(lǐng)域狀態(tài) 存在幾種用于判斷樣品中是否存在前帶效應(yīng)的方法： 樣品稀釋方法通過測試未稀釋樣品和稀釋后樣品來驗(yàn)證前帶效應(yīng)的存在。如果稀釋后 的結(jié)果高于未稀釋樣品，則未稀釋樣品最可能表現(xiàn)出前帶效應(yīng)。不幸地，該方法增加勞動(dòng)和 試劑成本。
[0006] 對(duì)于抗原再添加方法，將額外分析物在完成其測量之后添加至樣品，且解讀信號(hào) 中的額外變化。盡管該方法在檢測前帶效應(yīng)中是準(zhǔn)確的，但試劑成本由于抗原添加而增加。 此外，額外移取步驟增加分析儀上的工作流，因此導(dǎo)致通量降低。此外，抗原試劑占據(jù)分析 儀上的額外空間。
[0007] 動(dòng)力學(xué)方法通過分析樣品測量過程中獲得的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證抗原過量的存在。 在大多數(shù)情況下，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)取決于分析物濃度：低濃度樣品可顯示漸增信號(hào)，而高濃度樣 品可顯示在反應(yīng)開始時(shí)的更快速信號(hào)增加和在反應(yīng)結(jié)束時(shí)的低得多的信號(hào)增加。所述差異 可以用于識(shí)別前帶效應(yīng)的存在。
[0008] Rochecobasc分析儀上的應(yīng)用的動(dòng)力學(xué)方法也被稱為反應(yīng)速率方法。在這里， 比較最終試劑添加之后的兩個(gè)不同時(shí)間的吸光度變化的速率（參見cobasc操作員手冊(cè)； cobasc操作員手冊(cè)訓(xùn)練）：表示為百分?jǐn)?shù)的反應(yīng)結(jié)束時(shí)的反應(yīng)速率和反應(yīng)開始時(shí)的反應(yīng) 速率的比率被定義為前帶檢查值PC。對(duì)于各測定法，將表明前帶效應(yīng)的特定PC范圍（定 義為下限和上限之間的范圍）存儲(chǔ)于測定設(shè)置中，并且與測量各樣品之后獲得的PC值進(jìn)行 自動(dòng)比較（參見來自"cobasc311Analyzer-COBICD,CompendiumofBackground Information"的圖2、3和4)。在前帶效應(yīng)存在的情況下，用〉Kin標(biāo)記對(duì)于樣品獲得的結(jié) 果。
[0009] 任選地，至多兩個(gè)不同限值（參見圖4中的設(shè)置的第8個(gè)和第9個(gè)方框）可以在 Rochecobasc分析儀上定義且應(yīng)用于各測量，所述測量決定在分析樣品的前帶檢查值PC 之前如何進(jìn)行。這些限值是信號(hào)的參考值，其通過計(jì)算特定時(shí)間段內(nèi)的信號(hào)變化而在用于 分析物測定的波長處從樣品獲得。這些限值允許從前帶檢查忽略具有極低反應(yīng)速率的樣 品，且將此類樣品直接分類為非Hook樣品。cobasc分析儀中使用的動(dòng)力學(xué)方法的缺點(diǎn)在 于，Hook樣品和非Hook樣品之間的差異并不總是最優(yōu)的，因此當(dāng)通過進(jìn)行錯(cuò)誤標(biāo)記（例如 標(biāo)記為"超出上限測量范圍"，而不是"Hook樣品"，或反之亦然）而將方法應(yīng)用于來自相同 測定的不同批次時(shí)引起困難。
[0010] 該方法的一個(gè)進(jìn)一步重要缺點(diǎn)在于其不適用于所有測定法，例如白蛋白測定法， 且在此類情況下，必須應(yīng)用上述昂貴的抗原再添加方法，其通過額外移取步驟增加分析儀 上的工作流，因此導(dǎo)致通量降低。此外，抗原試劑占據(jù)分析儀上的額外空間。幾種前帶檢測 方法使用簡單的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析式。應(yīng)用此類方法的分析儀經(jīng)常關(guān)閉，這是因?yàn)榧偾皫?bào) 警率高（Clin.Chem.Lab.Med. 1999)。
[0011] 在來自JP06213893的動(dòng)力學(xué)方法中，任何測量點(diǎn)均用于前帶檢查。在JP 10282099中，通過比較測量時(shí)間內(nèi)的兩個(gè)測量部分彼此的測量數(shù)據(jù)而辨別前帶效應(yīng)的存在 或不存在。
[0012] 在JP63019560中，計(jì)算在波長λ?和λ2檢測的吸光度值Α(λ1)和Α(λ2)之間 的比率，且與預(yù)設(shè)辨別水平進(jìn)行比較，以檢測前帶效應(yīng)。
[0013] JP04204378描述了計(jì)算在兩種不同波長的吸光度差異ΛΑ(λ1)和ΛΑ(λ2)的比 率且將該值與預(yù)設(shè)參考值進(jìn)行比較的前帶檢測方法。
[0014] 在JP05093725和JP06094717中，進(jìn)行在2種不同波長的測量，隨后通過使用線 性回歸公式測定測量值和目標(biāo)值之間的偏差比率。基于偏差進(jìn)行前帶效應(yīng)的檢測。
[0015] ΕΡ1845373涉及用于使用特定校準(zhǔn)曲線測定樣品中分析物與分析物結(jié)合物質(zhì)的量 的方法，其中在不同的校準(zhǔn)曲線測定前帶陽性樣品的分析物的量。
[0016] 上面提到的現(xiàn)有技術(shù)使用昂貴試劑，需要額外測量或復(fù)雜的信號(hào)評(píng)估程序。此外， 一些方法并不總是適用于所有測定法。
[0017] 待解決的問題 待解決的問題是提供用于前帶檢測的方法，所述方法是成本有效的（理想地?zé)o需消耗 任何試劑）、快速的（理想地通過與樣品定量步驟同時(shí)進(jìn)行的檢測方法）、容易的、安全的 (理想地?zé)o假前帶報(bào)警/少量假前帶報(bào)警），且可以在自動(dòng)實(shí)驗(yàn)室分析儀中實(shí)施。
[0018] 本發(fā)明的方法允許成本有效的方式，而無需消耗任何試劑。它是快速且容易的，因 為所述前帶檢測方法與樣品定量步驟同時(shí)進(jìn)行，并且它是安全的，因?yàn)樗鼨z測樣品中是否 存在前帶效應(yīng)。此外，所述方法可以在自動(dòng)實(shí)驗(yàn)室分析儀中實(shí)施。
[0019] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供用于通過分析樣品測量過程中獲得的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來檢測前帶現(xiàn)象的改進(jìn) 方法。從屬權(quán)利要求中給出了本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0020] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明的方法用于通過光度測定法測定可以顯示前帶效應(yīng)的樣品 中特定分析物的量，其中所述特定分析物從所述分析物與分析物特異性測定試劑相互作用 之后反應(yīng)混合物的光信號(hào)變化來定量。
[0021] 在第一步驟中，對(duì)于待測定樣品的特定分析物生成在至少一個(gè)波長和反應(yīng)時(shí)間的 校準(zhǔn)曲線，且將測量結(jié)果儲(chǔ)存在儀器平臺(tái)的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)中。
[0022] 對(duì)于待測定樣品中的特定分析物，經(jīng)完整反應(yīng)時(shí)間，在用于測定分析物的波長和 至少在用于檢測前帶效應(yīng)的額外特定波長，同時(shí)測量光信號(hào)。該額外波長不同于用于測定 分析物的波長。
[0023] 在下一步驟中，通過使用在用于檢測前帶效應(yīng)的波長獲得的信號(hào)來計(jì)算反應(yīng)速率 比率R R=[時(shí)間段2時(shí)的反應(yīng)速率/時(shí)間段1時(shí)的反應(yīng)速率]X100,其中 時(shí)間段2時(shí)的反應(yīng)速率=[信號(hào)（時(shí)間點(diǎn)4)-信號(hào)（時(shí)間點(diǎn)3)] / [時(shí)間點(diǎn)4 -時(shí)間點(diǎn)3]且時(shí)間段1時(shí)的反應(yīng)速率=[信號(hào)（時(shí)間點(diǎn)2)-信號(hào)（時(shí)間點(diǎn)1)] / [時(shí)間 點(diǎn)2 -時(shí)間點(diǎn)1]。
[0024] 通過計(jì)算比率值R與預(yù)定限值的比較，判斷樣品中是否存在前帶效應(yīng)。
[0025] 最后，通過在用于測定分析物的波長獲得的光信號(hào)與校準(zhǔn)曲線的比較來定量特定 分析物的量。
[0026] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是任選地可以定義其它限值且應(yīng)用于各測量，所述測量決 定之前、即計(jì)算和基于反應(yīng)速率比率R判斷Hook效應(yīng)的存在之前如何進(jìn)行。這些限值是信 號(hào)的參考值，其在用于測定分析物的波長、和/或在用于檢測前帶效應(yīng)的波長和/或其它波 長測量。此限值的一個(gè)實(shí)例可以對(duì)于特定時(shí)間段內(nèi)的信號(hào)變化來定義，用于從前帶檢查忽 略具有極低反應(yīng)速率的樣品，且將此類樣品直接分類為非Hook樣品。此限值的一個(gè)進(jìn)一步 實(shí)例可以對(duì)于特定時(shí)間段內(nèi)的信號(hào)變化來定義，用于決定具有極高反應(yīng)速率的樣品是否被 立即分類為Hook樣品或是否在計(jì)算反應(yīng)速率比率R之后進(jìn)行判斷。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，提供使用可商購的分光光度實(shí)驗(yàn)室測試法的儀器平 臺(tái)，用于通過光度測定法測定可以顯示前帶效應(yīng)的樣品中特定分析物的量，其中所述儀器 平臺(tái)的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)能夠處理反應(yīng)時(shí)間、校準(zhǔn)點(diǎn)、校準(zhǔn)模式、波長的數(shù)據(jù)，用于從一次樣品 測量同時(shí)進(jìn)行分析物測定和前帶效應(yīng)檢測。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于通過光度測定法測定可以顯示前帶效應(yīng)的樣品中 白蛋白的量的方法，其中根據(jù)本發(fā)明從特定分析物與分析物特異性測定試劑相互作用之后 反應(yīng)混合物的光信號(hào)變化來定量所述分析物。
[0029] 發(fā)明詳述 本發(fā)明提供用于通過分析樣品測量過程中獲得的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來檢測前帶現(xiàn)象的改進(jìn) 方法。
[0030] 定義： 術(shù)語"分光光度測定法"，也稱為"光度測定法"，是本領(lǐng)域眾所周知的。光度測定法涵 蓋濁度和比濁免疫測定法。在濁度和比濁免疫測定法中，特定分析物從基于所述特定分析 物和分析物特異性結(jié)合配偶體的凝集的反應(yīng)混合物的濁度的變化來定量。
[0031] 術(shù)語"池度法（turbidimetry)和比池法（nephelometry) "是本領(lǐng)域已知用于基于 測量濁度對(duì)光的透射和散射的效果測定溶液中混濁的量或該濁度的方法。液體中的濁度是 由細(xì)分的懸浮顆粒的存在引起的。如果使光束通過混濁樣品，則其強(qiáng)度由散射而降低，并且 散射光的量取決于顆粒的濃度、尺寸和尺寸分布。分光光度計(jì)測量增加的濁度（即，強(qiáng)度透 射光中光的減少），這是由于由免疫凝集反應(yīng)導(dǎo)致的漸增的粒徑引起的。這種增加的濁度是 由分析物引起的免疫凝集的直接量度，或由分析物引起的免疫凝集抑制的間接量度。在比 濁法中，測量散射光的強(qiáng)度，而在濁度法中，測量透射通過樣品的光的強(qiáng)度。
[0032] 濁度測定法涉及測量當(dāng)入射光束通過樣品時(shí)入射光束的強(qiáng)度。光束可以通過懸浮 液或被顆粒吸收、反射或散射。作為結(jié)果，當(dāng)光透射通過懸浮液時(shí)，光的強(qiáng)度降低。對(duì)于非 吸收性顆粒，由于散射引起的光強(qiáng)度的降低表示為濁度。
[0033] 比濁測定法是指當(dāng)入射光束通過樣品時(shí)，測量從入射光束以定義角度Θ散射的 光。在比濁法中，測量一段時(shí)間后的散射光的強(qiáng)度的變化，因?yàn)樯⑸湮镔|(zhì)迅速增加尺寸。當(dāng) 在固定的抗體-膠乳復(fù)合物存在的情況下測量時(shí)，散射光與初始抗原濃度成比例。進(jìn)一步 的解釋描述于J.A.Molina-Bolivar等人，JournalofMacromolecularScience,Part C-PolymerReview, 45:59-98, 2005〇
[0034] 本發(fā)明的免疫測定方法在有和沒有微粒增強(qiáng)的情況下用所有已知凝集試驗(yàn)都起 作用。本發(fā)明中優(yōu)選使用"微粒增強(qiáng)