一種藜豆提取物的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藜豆提取物的檢測(cè)方法，本發(fā)明同時(shí)涉及所述檢測(cè)方法在藜豆屬 植物提取物質(zhì)量控制方面的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 藜豆屬植物在全球熱帶、亞熱帶地區(qū)均有分布，印度阿育吠陀傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛采 用藜豆治療帕金森病、毒蛇咬傷、男性不育等病癥，左旋多巴（LD)是其中主要有效成分。貓 豆是藜豆屬植物龍爪藜豆的干燥種子，主產(chǎn)于我國(guó)廣西、貴州等地區(qū)，具有溫中益氣、治療 腰脊酸痛的功效，同時(shí)也作為生產(chǎn)天然LD的主要原藥材使用。LD是治療帕金森病的一線用 藥，但長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能障礙（異動(dòng)癥）。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代藥理研究資料表明， 服用天然的藜豆提取物很少誘發(fā)移動(dòng)癥，因而在患者中受到歡迎。
[0003] 對(duì)藜豆提取物的質(zhì)量分析，目前僅限于LD的含量測(cè)定，但這不能區(qū)分天然提取物 來(lái)源和人工合成的LD。有文獻(xiàn)報(bào)道藜豆中存在LD衍生的3-羧酸-四氫異喹啉類成分，發(fā) 明人前期研究表明該類成分可進(jìn)入腦組織中協(xié)同LD起效（3-羧酸四氫異喹啉衍生物在制 備治療多巴胺能神經(jīng)疾病藥物中的應(yīng)用，專利申請(qǐng)?zhí)?01410312868. 5)。但該類組分極性 大、分離困難，目前缺乏有效的含量分析方法。本發(fā)明曾嘗試使用親水作用色譜柱分析藜豆 提取物中該類成分，各組分間分離度較好，但高含量的LD色譜峰容易出現(xiàn)過(guò)載、變形等現(xiàn) 象，同時(shí)流動(dòng)相需要高濃度的乙腈有機(jī)相，分析條件較為苛刻（譚蓓蓓等，親水作用色譜法 測(cè)定貓顯中左旋多巴及其衍生物的含量，蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2012, 32 :593-506)。為進(jìn)一 步控制藜豆提取物的質(zhì)量，本發(fā)明經(jīng)深入研究，首次建立了藜豆中該類成分的HPLC檢測(cè)方 法，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種藜豆提取物的檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明的又一目的是提供一種所述檢測(cè)方法在藜豆屬植物提取物質(zhì)量控制方面 的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的藜豆提取物的檢測(cè)方法由以下步驟組成：
[0007] (1)供試品溶液的制備：取藜豆提取物適量，精密稱定，用酸溶液配制為供試品溶 液，即得；
[0008] (2)對(duì)照品溶液的制備：取3-羧基-四氫異喹啉衍生物對(duì)照品適量，精密稱定，用 酸溶液配制為對(duì)照品溶液，即得；
[0009] (3)樣品分析：采用高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，親水性碳十八改性硅 膠色譜柱，甲醇溶液（0-5% )為流動(dòng)相等度洗脫，流速0. 5-1.Oml/min;分別精密吸取對(duì)照 品溶液和供試品溶液各5-20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，即得。
[0010] 所述檢測(cè)方法步驟（1)中，所述藜豆提取物為藜豆屬植物種子的提取物，例如藜 豆、貓豆等，其提取方法為文獻(xiàn)中公開(kāi)的溶劑提取法，其提取物也可選自市售產(chǎn)品。對(duì)于 藜豆屬植物種子原料，也可選用酸溶液超聲或室溫浸泡提取。其中，所述酸溶液可選自 鹽酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸等酸性溶液，所述酸濃度為0. 02-0. 2mol·LΙη?，其中優(yōu)選 0. 05-0.lmol噸1鹽酸。優(yōu)選制備方法為：取藜豆藥材粉碎為粗粉，各取1. 0g，精密稱定，置 具塞錐形瓶中，加0·lmol·L1鹽酸20mL，稱定重量，超聲60min，放冷，用0·lmol·L1鹽酸 補(bǔ)足重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。
[0011] 所述檢測(cè)方法步驟⑵中，所述3-羧基-四氫異喹啉衍生物對(duì)照品為3-羧基-6， 7- 二羥基-1，2, 3,4-四氛異卩奎琳（1)、1α-甲基-3-駿基_6, 7- __羥基-1，2, 3,4-四氛異 喹啉（2)、1，Γ-二甲基-3-羧基-6, 7-二羥基-1，2, 3,4_四氫異喹啉（3)中的任意1-3 種。根據(jù)需要，還可同時(shí)加入左旋多巴（LD)對(duì)照品。
[0012] 所述檢測(cè)方法步驟（3)中，所述甲醇溶液流動(dòng)相更優(yōu)選0-3% ;流動(dòng)相中可根據(jù)需 要，參考公開(kāi)文獻(xiàn)加入適宜濃度的酸或緩沖鹽（調(diào)節(jié)pH2-4)作為改性劑，例如甲酸、乙酸、 磷酸、乙酸銨、磷酸鹽緩沖溶液等，本發(fā)明中優(yōu)選1 %乙酸；流速優(yōu)選0. 5-0. 8mL·min、
[0013] 四氫異喹啉類成分1-3是藜豆中的特征性組分，可作為天然藜豆提取物的質(zhì)量控 制指標(biāo)。該類成分與LD結(jié)構(gòu)相似、極性強(qiáng)，在常規(guī)C18柱上幾乎沒(méi)有保留，分離度欠佳。本 發(fā)明經(jīng)深入研究，通過(guò)多種色譜柱比較，最終選用親水性的色譜柱和低濃度有機(jī)相（0-5% 甲醇溶液，含1 %乙酸）作為流動(dòng)相等度洗脫，組分1-3和LD均獲得了較為理想的基線分 離，從而首次建立了藜豆提取物中該類組分的同時(shí)定量分析方法。本發(fā)明所述檢測(cè)方法專 屬性強(qiáng)、靈敏度高、方法科學(xué)、簡(jiǎn)便易行，適用于對(duì)藜豆屬植物提取物中3-羧基-四氫異喹 啉類成分以及左旋多巴進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)和質(zhì)量控制。
[0014] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
是通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究和方法優(yōu)化完成的，以下述具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō) 明。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為混合對(duì)照品圖。圖中色譜峰1-3和LD依次為3-羧基-6，7-二羥基-1，2，3， 4_四氫異喹啉（1)、1α-甲基-3-羧基_6,7_二羥基-1，2,3,4-四氫異喹啉（2)、1，Γ-二 甲基-3-羧基-6, 7-二羥基-1，2, 3,4-四氫異喹啉（3)、左旋多巴。
[0016] 圖2為藜豆提取物的代表性HPLC譜圖。圖中色譜峰1-3和LD含義同圖1。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明所述的藜豆提取物的檢測(cè)方法是按以下實(shí)施例所表示的方法檢測(cè)，所涉及 到的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠掌握和運(yùn)用的技術(shù)手段。但以下實(shí)施例不得理解為任何 意義上的對(duì)本領(lǐng)域發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0018] 實(shí)施例1供試品溶液的制備
[0019] 3-羧基-四氫異喹啉類組分1-3及LD在水、乙醇等常規(guī)溶劑中溶解度差，同時(shí)容 易氧化，LD和其他組分含量差距大，因此原藥材供試品的制備方法較為關(guān)鍵。本發(fā)明選用酸 溶液超聲提取，通過(guò)對(duì)提取酸濃度（〇. 02-0. 2mol*LiHl)、提取溶劑用量（10,20,30倍）、 提取時(shí)間（30、60、90min)進(jìn)行考察優(yōu)化，最終建立了原藥材供試品的優(yōu)選制備方法，以及 相應(yīng)的藜豆提取物供試品溶液的制備方法。
[0020] 貓豆MD-1 (20091101，白色種皮，廣西百色）、貓豆MD-2 (20111212,黑色種皮，廣西 南寧）為藜豆屬植物龍爪藜豆