一種基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及制備和分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫學(xué)領(lǐng)域和化學(xué)發(fā)光分析領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于納米模擬酶的無 標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1928年Albrecht提出魯米諾的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象W來，魯米諾的化學(xué)發(fā)光體系在 生命分析、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、藥物分析等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā) 光免疫分析中，辣根過氧化酶（HR巧被廣泛運用于催化魯米諾（異魯米諾）-過氧化氨化學(xué) 發(fā)光體系。雖然HRP能夠高效催化過氧化氨已經(jīng)被應(yīng)用于各個領(lǐng)域，但是天然酶的穩(wěn)定性 差，易受溫度等環(huán)境因素影響，在保存過程中因其結(jié)構(gòu)的變化很容易喪失催化活性，而且其 催化活性也會因為大分子膚的活性位點包埋而被制約。與天然酶相比，模擬酶具有合成簡 單，穩(wěn)定性好，修飾方法簡易等優(yōu)點。因而，人們努力開發(fā)具有高催化活性和底物選擇性的 人工模擬酶，例如金屬離子、DNAzyme和化嘟都有很好的過氧化物酶催化活性，在化學(xué)發(fā)光 免疫分析中均已得到運用。
[0003] 由于功能納米材料的設(shè)計和納米技術(shù)的進步，一些具有特殊氧化還原催化能力的 納米粒子，如化3〇4、化0、化2〇3、Ce〇2等作為一種新型的模擬酶得到了深入的研究。硫化銅納 米顆粒作為一種重要的半導(dǎo)體納米材料，因為其出色的物理和化學(xué)性質(zhì)而受到越來越多的 關(guān)注。由于硫化銅納米顆粒是一種廉價、充足的材料，其在催化，太陽能電池，裡離子二次電 池的高容量負(fù)極材料和納米尺度的開關(guān)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。研究化e，W.W. Μ. ;Li，X.X. ;Lei，Y. ;Li,J. ;Zhao，H.X. ;Mi,LW. ;Zhang,LZ. ;Zheng,Z."Understanding theformationofCuSconcavesuperstructureswithperoxidase-likeactivity，，； Nanoscale，2012, 4, 3501-3506)表明，硫化銅納米粒子具有高效催化過氧化氨的模擬酶性 質(zhì)，但尚未運用到化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域中。
[0004] 目前無標(biāo)記免疫分析技術(shù)在免疫分析領(lǐng)域中引起了人們極大的研究興趣。無標(biāo) 記型免疫分析通過直接測定抗原抗體復(fù)合物形成時的物理、化學(xué)變化，極大地簡化制備和 操作過程，因此它具有檢測成本低，樣品用量少，檢測時間短等顯著優(yōu)勢，可W實現(xiàn)直接、實 時、原位、在線的痕量免疫分析。發(fā)明申請"一種無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光傳感器及其免疫分析方 法"（專利【申請?zhí)枴?014106705523)通過在界面上共固定辣根過氧化酶（HR巧和捕獲抗體， 雖然實現(xiàn)了對抗原的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光檢測，但是運個無標(biāo)記檢測策略有著如下需要改進之 處：1)需要同時使用傳統(tǒng)的天然酶（HR巧和固定載體（金納米粒子），增加了分析費用；2) 存在著HRP天然酶在化學(xué)發(fā)光檢測和儲存制備中容易失去生物活性的問題，造成化學(xué)發(fā)光 不穩(wěn)定；3)共固定辣根過氧化酶（HR巧和捕獲抗體在界面上，形成免疫復(fù)合物后，不能高效 地在酶表面形成一層復(fù)合物層來抑制化學(xué)發(fā)光底物向酶的擴散，造成抑制效率的降低。因 此，將成本非常低的硫化銅納米粒子應(yīng)用于魯米諾-過氧化氨化學(xué)發(fā)光體系，發(fā)展基于硫 化銅納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，具有非常重要的科學(xué)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及制備 和分析方法。其基本思路為：首先將殼聚糖溶液分散的硫化銅納米粒子修飾于環(huán)氧基活化 的載體片表面；再將鏈酶親和素固定于硫化銅納米粒子表面；隨后通過鏈酶親和素對生物 素的特異識別作用，將生物素化的抗體固定于載體片表面，牛血清蛋白封閉后制備得到無 標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。當(dāng)通入抗原樣品后，抗原-抗體特異反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物會 阻礙化學(xué)發(fā)光底物向信號界面擴散，抑制了硫化銅納米模擬酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，從而 引起化學(xué)發(fā)光強度降低。利用化學(xué)發(fā)光信號的降低和抗原濃度直接的線性關(guān)系，可實現(xiàn)對 抗原樣品的檢測。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供了一種基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征在于， 在環(huán)氧硅烷化的載體片上制備化學(xué)發(fā)光免疫傳感界面，其中，環(huán)氧硅烷層作為載體連接層， 所述化學(xué)發(fā)光免疫傳感界面包括納米模擬酶層作為化學(xué)發(fā)光信號層、鏈霉親合素層作為抗 體連接層，W及生物素化抗體層作為免疫識別層，其中，所述納米模擬酶層包括硫化銅納米 粒子和殼聚糖。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種制備上述基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的 方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0009] (1)將硫化銅納米粒子超聲分散于蒸饋水中，取硫化銅納米粒子懸浮液與殼聚糖 溶液等體積混合后用超聲至完全分散，將上述混合溶液滴涂到環(huán)氧硅烷化的載體片表面， 并在室溫下反應(yīng)直至驚干，在載體片表面形成一層硫化銅納米粒子的固體膜；
[0010] (2)取鏈酶親和素溶液均勻滴涂于上述硫化銅納米粒子膜表面，室溫下反應(yīng)后，再 放置在4°C下直至驚干；用憐酸鹽緩沖液沖洗；
[0011] (3)取生物素化的抗體均勻滴涂于上述鏈酶親和素功能化的載體片表面，室溫下 反應(yīng)后，用憐酸鹽緩沖溶液沖洗； 陽01引（4)將封閉液，牛血清白蛋白溶液，均勻滴涂于上述載體片表面，在4°C下封閉后， 用憐酸鹽緩沖溶液沖洗后，制得該無標(biāo)記免疫傳感器。
[0013] 進一步地，所述的納米模擬酶無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法的步驟（1)中，所述 的硫化銅納米粒子用量為1. 0~3.Omg，殼聚糖溶液的濃度為1. 0-2.Owt%。
[0014] 進一步地，所述的納米模擬酶無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法的步驟（2)中，所述 鏈酶親和素溶液的濃度為20~50μg/mL。
[0015] 進一步地，所述的納米模擬酶無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法的步驟（3)中，所述 生物素化的抗體的濃度為2~10μg/mL。
[0016] 進一步地，所述的納米模擬酶無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法的步驟（4)中，所述 封閉液為1. 0~5. 0 %牛血清白蛋白溶液。
[0017] 本發(fā)明還提供了的一種基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，包括如 下分析步驟：
[0018] (a)將上述制備方法中得到的無標(biāo)記免疫傳感器固定于薄層流通池中；
[0019] 化）將帶抗原的樣品W 0. 5血/min的速度注入流通池，在線溫育；
[0020] (c)用PBST溶液w1血/min的速度沖洗流通池，除去未反應(yīng)的免疫試劑；
[0021] (d)將化學(xué)發(fā)光底物溶液W0. 5mL/min的速度通入流通池，產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號 由化學(xué)發(fā)光檢測器記錄。
[0022] 可選地，上述步驟（a)中，將制得到的無標(biāo)記免疫傳感器固定于薄層流通池中，流 通池的體積為60~80μL。
[0023] 可選地，上述步驟（C)中所使用的化學(xué)發(fā)光檢測器為光電倍增管，設(shè)置負(fù)高壓為 500 ~700V。
[0024] 本發(fā)明達到了如下的有益效果：
[00巧]本發(fā)明成功構(gòu)建了基于硫化銅納米模擬酶的化學(xué)發(fā)光新體系；該發(fā)明首先將殼聚 糖溶液分散的硫化銅納米粒子修飾于環(huán)氧基活化的載體片表面，接下來將鏈酶親和素固定 于硫化銅納米粒子表面，通過鏈酶親和素對生物素的特異識別作用，最后將生物素化的抗 體固定于載體片表面，制備得到無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。此外，構(gòu)建了一種基于硫化銅 納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[00%] (1)本發(fā)明使用化S模擬酶，一方面利用其高效催化過氧化氨的模擬酶性質(zhì)，引入 化學(xué)發(fā)光體系來取代傳統(tǒng)的天然酶（HRP)，改善了天然酶穩(wěn)定性差，易受環(huán)境影響等缺點， 構(gòu)建了基于納米模擬酶的化學(xué)發(fā)光新體系，使得構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光體系的穩(wěn)定性和靈敏度得 到顯著的提高；另一方面硫化銅納米粒子具有納米尺寸，高的比表面積，能夠作為界面上的 固定載體，固定更多鏈霉親和素，從而構(gòu)建更高效的傳感界面；此外，化S制備方法簡單，原 料便宜。運些優(yōu)點，使得化S納米粒子的使用有效地降低了成本。
[0027] (2)本發(fā)明先將化S納米模擬酶固定到界面上，然后通過鏈酶親和素與生物素結(jié) 合（即：生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，BSAS)，將抗體成功固定到化S納米模擬酶表面。相對于 在固相界面上共固定探針和抗體，本發(fā)明在化學(xué)發(fā)光信號層上面修飾免疫識別層，免疫分 析時，捕獲抗原后能在酶表面更有效的形成免疫復(fù)合物，從而更有效地阻礙化學(xué)發(fā)光底物 向化S模擬酶的擴散而抑制化學(xué)發(fā)光。
[0028] (3)此外，生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)由于其高特異性、強親和力的優(yōu)點，一個鏈霉 親和素可W連接四個生物素的放大作用，可W更有效地在鏈霉親和素功能化的化S納米模 擬酶表面固定大量生物素化抗體，從而構(gòu)建更高效的傳感界面，形成