的免疫復合物可W顯 著抑制模擬酶催化的化學發(fā)光反應。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明免疫傳感器的制作和免疫分析示意圖。
[0030] 圖2為本發(fā)明AFP標準樣品檢測的線性曲線。
[0031] 圖中，1.硫化銅納米粒子；2.殼聚糖；3.鏈霉親和素；4.生物素化的抗體點抗 原；6.化學發(fā)光底液；7.GPTMS(丫-環(huán)氧丙氧丙基Ξ甲氧基硅烷）；a.強化學發(fā)光；b.弱化 學發(fā)光。
【具體實施方式】
[0032] 為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明 做進一步的介紹。 陽〇3引實施例1
[0034] 本發(fā)明提供了一種基于硫化銅納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫分析方法用于 檢測甲胎蛋白（AFP)，其特征在于該AFP無標記免疫傳感器的制備方法包括W下步驟：
[0035] (1)將2. Omg硫化銅納米粒子超聲分散于1. OmL蒸饋水中，取硫化銅納米粒子懸浮 液與1. Owt%殼聚糖溶液等體積混合后用超聲至完全分散；取20. 0 μ L上述混合溶液，將其 滴涂到環(huán)氧硅烷化的玻璃片表面，并在室溫下反應直至驚干，在玻璃表面形成一層硫化銅 納米粒子的固體膜；
[0036] 似取50μg/血鏈酶親和素溶液20μL均勻滴涂與上述硫化銅納米粒子膜表面， 室溫下反應30min，然后在4°C放置10-1化；用憐酸鹽緩沖液沖洗Ξ次；
[0037] (3)取1 μ g/mL生物素化的AFP抗體20 μ L均勻滴涂于上述鏈酶親和素功能化的 玻璃片表面，室溫下反應化；用憐酸鹽緩沖溶液沖洗Ξ次；
[0038] (4)將1. 0%牛血清白蛋白溶液20μL均勻滴涂于上述玻璃片表面，在4°C下封閉 lOh，用憐酸鹽緩沖溶液沖洗Ξ次后，制得該無標記免疫傳感器。
[0039] 實施例2
[0040] 對實施例1中所獲得的基于硫化銅納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器進 行免疫分析方法包括：
[0041] (1)將上述制備方法中得到的AFP無標記免疫傳感器固定于薄層流通池中，流通 池置于固定于薄層流通池化學發(fā)光檢測器之上；
[0042] (2)將帶AFP抗原的樣品通過溶液傳送裝置W0.5mL/min的速度注入流通池，在線 溫育20~30分鐘； 陽0創(chuàng)做將沖洗緩沖液PBST溶液W1血/min的速度沖洗流通池2~3分鐘，除去未反 應的免疫試劑；
[0044] (4)將化學發(fā)光底物溶液（lumin〇U5mM)-PIP(0.6mM)-&〇2(4mM))通過W 0.5血/ min的速度通入流通池，流通池中的無標記免疫傳感器產(chǎn)生化學發(fā)光信號，產(chǎn)生的化學發(fā)光 信號由處于傳感器下方的化學發(fā)光檢測器記錄，設置負高壓為600V。 W45] 如圖2所示，測定不同濃度的AFP標準樣品，制得AFP標準樣品的線性曲線。制得 標準曲線后，為考察該基于硫化銅納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫分析新方法的實際應 用的可靠性，進行了人血清樣品的檢測，并與標準方法（表1中樣品1-5的參考值由江蘇省 腫瘤醫(yī)院提供，由商品化的電化學發(fā)光免疫分析儀測量）進行了比較，實驗結(jié)果如表1所 示：
[0046]表1
[0047]
引實施例3
[0049] 本發(fā)明提供了一種基于硫化銅納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫分析方法用于 檢測癌胚抗原（CEA)，其特征在于，其CEA無標記免疫傳感器的制備方法包括W下步驟：
[0050] (1)將3.Omg硫化銅納米粒子超聲分散于1.OmL蒸饋水中，取硫化銅納米粒子懸浮 液與2.Owt%殼聚糖溶液等體積混合后用超聲至完全分散；取20. 0μL上述混合溶液，將其 滴涂到環(huán)氧硅烷化的玻璃片表面，并在室溫下反應直至驚干，在玻璃表面形成一層硫化銅 納米粒子的固體膜；
[0051] 似取30μg/血鏈酶親和素溶液20μL均勻滴涂與上述硫化銅納米粒子膜表面， 室溫下反應30min，然后在4°C放置12h;用憐酸鹽緩沖液沖洗Ξ次；
[0052] (3)取1μg/mL生物素化的CEA抗體20μL均勻滴涂于上述鏈酶親和素功能化的 玻璃片表面，室溫下反應化；用憐酸鹽緩沖溶液沖洗Ξ次； 陽化引 （4)將2. 0%牛血清白蛋白溶液20μL均勻滴涂于上述玻璃片表面，在4°C下封閉 12h，用憐酸鹽緩沖溶液沖洗Ξ次后，制得該無標記免疫傳感器；
[0054] 隨后，將制得到的無標記免疫傳感器固定于薄層流通池中，流通池的體積60μ以 使用該無標記免疫傳感器進行免疫分析的方法如實施例2。
[0055] W上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù) 人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，本發(fā)明 要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。
【主權(quán)項】
1. 一種基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器，其特征在于，在環(huán)氧硅烷化的 載體片上制備化學發(fā)光免疫傳感界面，所述化學發(fā)光免疫傳感界面包括納米模擬酶層、鏈 霉親和素層以及生物素化抗體層，其中，所述納米模擬酶層包括硫化銅納米粒子和殼聚糖。2. 如權(quán)利要求1所述的一種基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器，其特征在 于，所述載體片為玻璃片。3. -種制備如權(quán)利要求1或2所述的基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器的 方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將硫化銅納米粒子超聲分散于蒸餾水中，取硫化銅納米粒子懸浮液與殼聚糖溶液 等體積混合后用超聲至完全分散；將上述混合溶液滴涂到環(huán)氧硅烷化的載體片表面，并在 室溫下反應直至晾干； (2) 取鏈酶親和素溶液均勻滴涂于上述硫化銅納米粒子膜表面，室溫下反應后，再放置 在4°C直至晾干，隨后用磷酸鹽緩沖液沖洗； (3) 取生物素化的抗體均勻滴涂于步驟（2)中的制得的鏈酶親和素功能化的載體片表 面，室溫下反應后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗； (4) 將作為封閉液的牛血清白蛋白溶液，均勻滴涂于步驟（3)中得到的載體片表面，在 4°C下封閉后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗。4. 如權(quán)利要求3所述的一種制備基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器的方 法，其特征在于，步驟（1)中，所述的硫化銅納米粒子用量為1. 0~3.Omg，殼聚糖溶液的濃 度為 1. 0 ~2.Owt%。5. 如權(quán)利要求4所述的一種制備基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器的方 法，其特征在于，步驟（2)中，所述鏈酶親和素溶液的濃度為20~50μg/mL。6. 如權(quán)利要求5所述的一種制備基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器的方 法，其特征在于，步驟（3)中，所述生物素化的抗體的濃度為2~10μg/mL。7. 如權(quán)利要求6所述的一種制備基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器的方 法，其特征在于，步驟（4)中，所述封閉液為1.0~5.0%牛血清白蛋白溶液。8. -種基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫分析方法，其特征在于，包括如下分析 步驟： (a) 將如權(quán)利要求1或2中所述的基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器固定 于薄層流通池中； (b) 將帶抗原的樣品以0. 5mL/min的速度注入流通池，在線溫育； (c) 用PBST溶液以lmL/min的速度沖洗流通池，除去未反應的免疫試劑； (d) 將化學發(fā)光底物溶液以0. 5mL/min的速度通入流通池，產(chǎn)生的化學發(fā)光信號由化 學發(fā)光檢測器記錄。9. 如權(quán)利要求8所述的基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫分析方法，其特征在 于，步驟（a)中，將制得到的無標記免疫傳感器固定于薄層流通池中，流通池的體積為60~ 80μL〇10. 如權(quán)利要求8或9所述的基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫分析方法，其特征 在于，步驟（c)中所使用的化學發(fā)光檢測器為光電倍增管，設置負高壓為500~700V。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器及制備和分析方法：首先將殼聚糖溶液分散的硫化銅納米粒子修飾于環(huán)氧基活化的載體片表面；再將鏈酶親和素固定于硫化銅納米粒子表面；隨后通過鏈酶親和素對生物素的特異識別作用，將生物素化的抗體固定于載體片表面，牛血清蛋白封閉后制備得到無標記化學發(fā)光免疫傳感器。硫化銅納米模擬酶的使用，改善了傳統(tǒng)化學發(fā)光免疫分析中天然酶穩(wěn)定性差，易受環(huán)境影響等缺點，使得構(gòu)建的化學發(fā)光體系的穩(wěn)定性和靈敏度得到顯著的提高，并且大大降低了檢測費用，具有非常重要的應用價值和實際意義。
【IPC分類】G01N21/76, G01N33/543
【公開號】CN105403696
【申請?zhí)枴緾N201510919955
【發(fā)明人】楊占軍, 曹越, 李娟
【申請人】揚州大學
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月11日