用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學領(lǐng)域，設(shè)及冠屯、病診斷分型的代謝標志物，具體設(shè)及一組用 于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠屯、病亦稱為缺血性屯、臟病，設(shè)及供應屯、肌血液的動脈發(fā)生粥樣硬化，即冠狀動 脈粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或斑塊形成甚至破裂、完全堵塞，造成屯、肌缺血、缺氧或壞 死而導致屯、臟缺血性疾病，從而引起臨床上屯、絞痛、屯、肌梗死等一系列嚴重的屯、血管事件。 冠屯、病是人類健康的主要殺手，具發(fā)病率高、致殘率高、復發(fā)率高、病死率高、并發(fā)癥多等特 點，已經(jīng)成為威脅我國人民健康的主要疾病。
[0003] 目前，基于病理生理機制，將冠屯、病分為慢性穩(wěn)定性冠屯、?。捶€(wěn)定型屯、絞痛）和 急性冠脈綜合征；急性冠脈綜合征又進一步分為不穩(wěn)定型屯、絞痛和急性屯、肌梗死。冠屯、病 從無至有、從輕至重通常包括如下發(fā)展階段:冠狀動脈正常^冠狀動脈粥樣硬化^穩(wěn)定型 屯、絞痛^不穩(wěn)定型屯、絞痛^急性屯、肌梗死。
[0004] 冠狀動脈粥樣硬化是冠屯、病的主要病因，是冠屯、病的早期病癥。冠狀動脈粥樣硬 化是一種常見的進行性動脈疾病，病變主要累及中等大小的肌層動脈，動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積， 平滑肌細胞增生，形成局限性斑塊，可使動脈壁變硬，嚴重時斑塊破裂導致血栓、栓塞、出 血，受累管腔部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為動脈粥樣硬化血管并發(fā)癥的發(fā)生。動脈粥樣硬化 早期病變可發(fā)生在10歲之前，病變引起動脈狹窄需經(jīng)歷20至30年時間，早期無臨床癥狀，不 易被發(fā)現(xiàn)和重視，因此對冠狀動脈粥樣硬化的早期預防和診斷可W有效地防止冠屯、病的發(fā) 生。
[0005] 冠狀動脈造影可W對冠狀動脈的狹窄程度作出準確的判斷，是診斷冠屯、病的金標 準[冠狀動脈造影金標準與臨床常規(guī)診斷冠屯、病差異性比較研究，舒榮文等，海軍醫(yī)學雜志 2015年04期]。作為冠屯、病診斷的金標準，冠脈造影只能發(fā)現(xiàn)血管狹窄程度，而且它還是一 種介入測量手段，需要介入手術(shù)，且診斷昂貴。另一方面，醫(yī)生還需要依據(jù)對患者的屯、電圖、 屯、動圖、平板運動試驗、CT等檢查結(jié)果作出最終診斷，由于醫(yī)生主觀性判斷、病人敘述不清 等情況的出現(xiàn)，對冠屯、病的診斷仍存在較大的誤診和漏診，運對病人的預后影響非常大。為 了改善患者的生活質(zhì)量，降低患者受到的生命威脅，我們亟需發(fā)展一種具有診斷率高、經(jīng) 濟、無侵入性、操作簡便等特性的診斷方法。
[0006] 代謝組學是研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其隨內(nèi)因和外因變化的科學，是 系統(tǒng)生物學的一個重要組成部分。它可W對體液如血液和尿液進行快速及無侵入性的分 析，通過代謝譜的差異獲得可W指示各種生化反應的代謝標志物。目前常用的分析技術(shù)包 括核磁共振(NMR)、質(zhì)譜化C-MS/GC-MS)等。LC-MS/GC-MS具有對樣本制備要求低、靈敏度高、 動態(tài)范圍寬等特點，可用于檢測樣本中濃度相差大的代謝物，因而成為代謝組學的研究中 應用越來越多的技術(shù)平臺。血漿分析是臨床上常用的一種疾病診斷方法，因其簡便、快速、 經(jīng)濟且相對無創(chuàng)的優(yōu)點而被廣泛采用。
[0007] 目前尚未有人使用血漿代謝物水平對冠屯、病進行診斷分型。應用血漿代謝組學尋 找冠狀動脈正常人與冠狀動脈粥樣硬化患者及不同分型冠屯、病患者血漿代謝物的水平差 異對于臨床早期快速確診冠屯、病并進行分型具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明第一目的在于提供一組用于診斷急性冠脈綜合 征的代謝標志物，該組代謝標志物同時存在于血漿中，可同時分析測定;本發(fā)明的第二目的 在于提供一種能夠靈敏地分析檢測所述代謝標志物的方法;本發(fā)明的第Ξ目的在于提供所 述代謝標志物在篩選治療或緩解急性冠脈綜合征的藥物中的應用;本發(fā)明的第四目的在于 提供一種基于所述代謝標志物的檢測試劑盒，用于診斷急性冠脈綜合征，提高診斷便利性， 促進診斷方法標準化。
[0009] 上述目的是通過如下技術(shù)方案得W實現(xiàn)的：
[0010] -組用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物，包括一個或多個如下所述的代謝標 志物:憐酸膽堿、棟桐酷乙醇胺、溶血憐脂酷膽堿（16:0)、憐脂酷神經(jīng)酷胺(dl8:1/8:0)、溶 血憐脂酷膽堿(18:2)、溶血憐脂酷膽堿(18:1)和憐脂酷肌醇（18:3/0:0)。
[0011] 溶血憐脂酷膽堿(16:0)，即1-棟桐酷-甘油-3-憐脂酷膽堿。
[0012] 憐脂酷神經(jīng)酷胺（dl8:l/8:0)，即{[(2S，3R)-2-八碳酷胺-3-徑基十八醇]氧}麟 酸。
[0013] 溶血憐脂酷膽堿(18:2)，即1-亞油酷-甘油-3-憐脂酷膽堿。
[0014] 溶血憐脂酷膽堿(18:1)，即1-油酷-甘油-3-憐脂酷膽堿。
[0015] 憐脂酷肌醇（18:3/0:0 )，即1-亞麻酷甘油憐脂酷肌醇。
[0016] 進一步地，所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物，包括任意Ξ個所述的 代謝標志物。
[0017] 進一步地，所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物，包括任意四個所述的 代謝標志物。
[0018] 進一步地，所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物，包括任意五個所述的 代謝標志物。
[0019] 進一步地，所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物，包括全部屯個所述的 代謝標志物。
[0020] 進一步地，所述的代謝標志物來源于血漿。
[0021] -種定性或定量分析所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標志物的方法為:采 用液質(zhì)聯(lián)用和/或氣質(zhì)聯(lián)用對所述的代謝標志物進行定性或定量分析。液質(zhì)和氣質(zhì)檢測限 低、靈敏度高，能靈敏地分析檢測生物樣本中的代謝標志物并對其定量。
[0022] 所述的代謝標志物在篩選治療或緩解急性冠脈綜合征的藥物中的應用。
[0023] -種用于診斷急性冠脈綜合征的檢測試劑盒，包括所述的代謝標志物的標準品， 所述標準品為各代謝標志物的化學單體或混合物。使用標準品可W對生物樣本中的代謝標 志物進行快速準確地定性、定量分析。試劑盒有助于實現(xiàn)檢測標準化，提高檢測便利性和重 現(xiàn)性。
[0024] 進一步地，所述檢測試劑盒還包括溶解所述標準品的溶劑和/或提取富集所述代 謝標志物的溶劑。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0026] (1)本發(fā)明提供的代謝標志物能準確地診斷急性冠脈綜合征。R0C曲線評價方法 中，R0C曲線下面積AUC在大于0.5的情況下，越接近于1，說明診斷效果越好。AUC在0.5~0.7 時有較低準確性，AUC在0.7~0.9時有一定準確性，AUC在0.9 W上時有較高準確性。經(jīng)驗證， 本發(fā)明提供的代謝標志物單個用于診斷區(qū)分急性冠脈綜合征患者和冠狀動脈正常人時， AUC均在0.7 W上;多個聯(lián)合應用時，AUC比單個更接近于1，診斷效果更好;屯個聯(lián)合應用時， AUC最接近于1，診斷區(qū)分效果最好。
[0027] (2)本發(fā)明提供的分析檢測所述代謝標志物的方法靈敏度高，結(jié)果準確可靠。
[0028] (3)本發(fā)明提供的代謝標志物可W有效診斷急性冠脈綜合征的病情是否得到緩 解，可W用于篩選治療或緩解急性冠脈綜合征的藥物。
[0029] (4)本發(fā)明提供的檢測試劑盒可W用于診斷急性冠脈綜合征，提高診斷便利性，促 進診斷方法標準化。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明實質(zhì)性內(nèi)容。使用的儀器或試劑未做詳細說明 的均為常規(guī)儀器和試劑;未具體描述的試驗操作方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的常規(guī) 操作方法。
[0031] 實施例1:冠狀動脈正常人和急性冠脈綜合征患者之間血漿差異代謝物的篩選表 征
[0032] 一、對象和方法
[0033] 1、標本來源
[0034] 在取得患者同意后，收集江蘇省人民醫(yī)院2010年9月~2015年6月460例急性冠脈 綜合征患者和350例冠狀動脈正常人的外周靜脈血血漿，所有患者或冠狀動脈正常人均經(jīng) 冠脈造影證實。冠狀動脈正常人的年齡、性別與急性冠脈綜合征患者相匹配。所有急性冠脈 綜合征患者和冠狀動脈正常人均有正常屯、肺肝腎及造血功能。
[003日]義血時間均為清晨至腹狀態(tài)。
[0036] 2、主要試劑
[0037] 乙臘及甲酸化化C純）購于美國ROE公司；色譜級別甲醇和氯仿購于江蘇漢邦科技 有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺(含1%Ξ甲基氯硅烷)購于美 國Sigma-Al化ich公司；去離子水由美國密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超純水系統(tǒng)制 備;標準品包括憐酸膽堿、棟桐酷乙醇胺、溶血憐脂酷膽堿(16:0)、憐脂酷神經(jīng)酷胺(dl8:l/ 8:0)、溶血憐脂酷膽堿（18:2)、溶血憐脂酷膽堿（18:1)和憐脂酷肌醇（18:3/0:0)，購于美國 Sigma-Aldrich。
[0038] 3、血漿差異代謝物的篩選表征
[0039] 3.1UPLC-Q/T0F-MS 篩選表征
[0040] 3.1.1樣品制備
[0041] 利用響應面法進行提取溶劑優(yōu)化：W質(zhì)譜ESI+和ESI-檢測模式下的峰個數(shù)和總峰 面積為因素考察不同溶劑（乙臘、甲醇、乙醇、氯仿、水)對血漿中代謝物的提取富集效率。將 實驗測得數(shù)據(jù)進行多變量分析，利用化s模型中重要性因子（variable impodance to projection, VIP值)反映變量對模型響應的重要性。乙臘、甲醇、乙醇、氯仿、水的VIP值依次 為1.503，0.802，0.651，0.688和0.987，乙臘的提取效率最高，故選擇乙臘作為血漿樣本的 提取溶劑。
[0042] 樣品處理：取100化血漿于1.5mL離屯、管中，加入400化乙臘，滿旋30秒后混勻， 1300化pmX lOmin離屯、(4°C)，取20化L上清于1.5mL離屯、管中，在室溫下用氮吹儀吹干，所得 殘渣用3(Κ)化的20 %乙臘水溶液溶解，即得。
[0043] 3.1.2試驗條件及參數(shù)
[0044] UPLC-Q/T0F-MS 條件：
[0045] 色譜分離采用超高效液相色譜化化C，Agilent 1290，USA)。色譜柱為Waters邸Η C18柱（100mmX 2.1mm，1.7皿），柱溫25°C，進樣室溫度為室溫，進樣量化L。正、負離子模式流 動相組成均是A為體積濃度0.1 %甲酸水溶液，B為體積濃度0.1 %甲酸乙臘溶液。梯度洗脫 條件:0~Imin為0~30%B相，2min內(nèi)B相線性增加到60%，3~8min線性