變化至90%B相，然 后在8~9min線性增加至100%B相并保持Imin;流速0.3mL/min，柱后流出液不經(jīng)分流直接 導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。
[0046] 質(zhì)譜分析采用四級桿-飛行時間質(zhì)譜(Agilent 6530Q-T0F/MS，USA)dW電噴霧離 子源化SI)正、負(fù)離子模式檢測;干燥氣流速為化/min，干燥氣溫度為300°C，干燥氣和錐孔 氣均為高純氮氣;離子源溫度l〇〇°C，正離子和負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓均為3000V，碰撞電 壓為100V;采用全掃描模式每秒進(jìn)行Ξ次數(shù)據(jù)采集，掃描質(zhì)量范圍:m/z 100-1000道爾頓。
[0047] 3.2GC-Q/MS 篩選表征 [004引 3.2.1樣品制備
[0049] 取20化L血漿于1.5mL離屯、管中，加入50化Img/mL的2-異丙基蘋果酸溶液內(nèi)標(biāo)，滿 旋20秒混勻，加入4(Κ)化甲醇、氯仿和水的混合溶液(比例為2.5:1:1)，然后在70°C的金屬浴 上振搖30min(1200巧m)，16000gX 5min離屯、（4°C)，取500yL上清于1.5mL離屯、管中，加入500 化蒸饋水，滿旋混勻，然后16000gX5min離屯、(4°C)，取500化上清于1.5mL離屯、管中，在室溫 下用氮吹儀吹干，所得殘渣用80化的甲氧胺化晚溶液溶解，在50°C條件下目虧化化，加入60化 N-甲基-Ν-Ξ甲基娃基Ξ氣乙酷胺，在70°C條件下衍生化化，即得。
[0化0] 3.2.2試驗條件及參數(shù)
[0051] GC-Q/MS條件:美國Agilent 7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜柱HP-5MS毛 細(xì)管柱（30.0 mX 0.25mm，毛細(xì)管厚度0.25皿）；載氣為高純氮氣，流速1. OmL/min;進(jìn)樣量化 L程序升溫:80°C恒溫2min，80°C-300°C (5°C/min)恒溫6min;不分流，進(jìn)樣溫度300°C;接口 溫度300°C;離子源溫度200°C;電子能量50eV;溶劑延遲3min;采用全掃描模式，掃描質(zhì)量范 圍：m/z 30-600道爾頓。
[0052] 4、數(shù)據(jù)處理和分析
[0053] 將 UPLC-Q/T0F-MS 和 GC-Q/MS 得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SIMCA 軟件（version 13.0.2， Umetr ics)進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。通過建立0PLS-DA (正交偏最小二乘法-判別分析)模型，尋找 冠狀動脈正常人和急性冠脈綜合征患者之間代謝輪廓貢獻(xiàn)較大(VIP>1.0且p<〇.01)的代 謝物。
[0054] 通過HMDB化t1:p: //www. hm化.ca/)和Metl ine 化t1:p: //metl in. scri卵S. edu/)等 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢索，利用數(shù)據(jù)庫中提供的精確分子量和質(zhì)譜所得的MS/MS圖譜初 步鑒定上述差異代謝物的結(jié)構(gòu)。最終通過購買標(biāo)準(zhǔn)品，用標(biāo)準(zhǔn)品的分子量、色譜保留時間和 相應(yīng)的多級MS裂解譜比對，確證差異代謝物的結(jié)構(gòu)。
[005引二、結(jié)果
[0056] 篩選表征出7個差異代謝物，分別為：憐酸膽堿、棟桐酷乙醇胺、溶血憐脂酷膽堿 (16:0)、憐脂酷神經(jīng)酷胺(dl8:1/8:0)、溶血憐脂酷膽堿（18:2)、溶血憐脂酷膽堿（18:1)和 憐脂酷肌醇（18:3/0:0)。
[0057] 與冠狀動脈正常人相比，上述7個差異代謝物在急性冠脈綜合征患者血漿中的表 達(dá)水平均下調(diào)。通過標(biāo)準(zhǔn)品定量檢測，與冠狀動脈正常人相比，上述差異代謝物在急性冠脈 綜合征患者血漿中的表達(dá)水平下調(diào)0.7~0.8倍。由此可見，上述7個差異代謝物在急性冠脈 綜合征患者和冠狀動脈正常人血漿中的表達(dá)水平明顯不同，可W用于診斷急性冠脈綜合 征。
[0058] 實施例2:構(gòu)建R0C曲線驗證7個差異代謝物用于診斷急性冠脈綜合征的能力
[0059] 采用受試者工作曲線(R0C)法進(jìn)行驗證，通過急性冠脈綜合征患者和冠狀動脈正 常人血漿中差異代謝物的表達(dá)水平判斷其用于診斷冠屯、病的能力。結(jié)果表明，憐酸膽堿、棟 桐酷乙醇胺、溶血憐脂酷膽堿（16:0)、憐脂酷神經(jīng)酷胺(dl8:1/8:0)、溶血憐脂酷膽堿（18: 2)、溶血憐脂酷膽堿（18:1)和憐脂酷肌醇（18:3/0:0)運(yùn)7個差異代謝物單個用于診斷區(qū)分 急性冠脈綜合征患者和冠狀動脈正常人的能力較強(qiáng)，R0C曲線下面積(AUC)均大于0.7,具有 臨床診斷意義;聯(lián)合用于診斷時，隨著聯(lián)合個數(shù)的增加，AUC進(jìn)一步提高，7個全部聯(lián)合時最 高，AUC達(dá)0.987，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為99.1 %和98.9 %。單個及任意2 ~6個聯(lián)合診斷結(jié)果見表1~3。
[0060] 表1單個差異代謝物診斷區(qū)分冠狀動脈正常人和急性冠脈綜合征患者
[0061 ]_
[00創(chuàng)~表2兩個差異代謝物聯(lián)合診斷區(qū)分冠狀動脈正常人和急性冠脈綜合征患者 [0063]
[0065] 表3任意Ξ~六個差異代謝物聯(lián)合診斷區(qū)分冠狀動脈正常人和急性冠脈綜合征患 者
[0066]
[0067]從表1可W看出，運(yùn)7個差異代謝物單個用于診斷區(qū)分冠狀動脈正常人和急性冠度夫 綜合征患者的能力較強(qiáng)，AUC均大于0.7,靈敏度較高、特異性較強(qiáng)，具有臨床診斷意義;從表 2可W看出，運(yùn)7個差異代謝物兩兩聯(lián)合用于診斷時，AUC比單個用于診斷時更高，靈敏度高、 特異性較高，具有臨床診斷意義;從表3可W看出，用運(yùn)7個差異代謝物中的3~6個聯(lián)合用于 診斷時，AUC進(jìn)一步提高，靈敏度高、特異性強(qiáng)，具有臨床診斷意義。
[0068] 因此，運(yùn)7個差異代謝物可W作為用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物。
[0069] 實施例3:在篩選治療或緩解急性冠脈綜合征的藥物中的應(yīng)用
[0070] 對190例急性冠脈綜合征患者藥物治療前和藥物治療后的血漿進(jìn)行檢測，結(jié)果表 明：隨著藥物治療療程的增加，患者病情逐步緩解，本發(fā)明提供的7個代謝標(biāo)志物在血漿中 的水平逐漸趨于健康人的水平，且完全治愈后與健康人的血漿水平無顯著性差異（P> 0.05)。該結(jié)果與冠脈造影的檢測結(jié)果一致。因此，可利用本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物篩選治 療或緩解急性冠脈綜合征的藥物。
[0071] 實施例4:檢測試劑盒的制備
[0072] 基于本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物制備了檢測試劑盒，該試劑盒包括如下成分：
[0073] 代謝標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品：包括憐酸膽堿、棟桐酷乙醇胺、溶血憐脂酷膽堿（16:0)、憐 脂酷神經(jīng)酷胺(dl8:1/8:0)、溶血憐脂酷膽堿（18:2)、溶血憐脂酷膽堿（18:1)和憐脂酷肌醇 (18:3/0:0)，各標(biāo)準(zhǔn)品分別封裝；
[0074] 血漿代謝物提取溶劑：100%乙臘和20%乙臘水溶液（用于UPLC-Q/T0F-MS樣品制 備）；比例為2.5:1:1的甲醇、氯仿和水的混合溶液、甲氧胺化晚和N-甲基-Ν-Ξ甲基娃基Ξ 氣乙酷胺（用于GC-Q/MS樣品制備）；UPLC-Q/T0F-MS篩選表征中，20%乙臘水溶液可W用作 溶解標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑;GC-Q/MS篩選表征中，用血漿代謝物提取溶劑按樣品制備的方法制備標(biāo) 準(zhǔn)品溶液；
[0075] 內(nèi)標(biāo):2-異丙基蘋果酸。
[0076] 當(dāng)然，設(shè)計檢測試劑盒時，并不需要完全包含上述7個代謝標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，可W 僅使用其中幾個進(jìn)行組合。運(yùn)些標(biāo)準(zhǔn)品可W單獨封裝，也可W制成混合物封裝。
[0077] 該試劑盒是基于本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物而設(shè)計的，可W用于診斷區(qū)分冠狀動脈 正常人和急性冠脈綜合征患者，用于診斷急性冠脈綜合征。
[0078] 綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，且具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。
[0079] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一組用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物，其特征在于，包括一個或多個如下所 述的代謝標(biāo)志物:磷酸膽堿、棕櫚酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿(16:0)、磷脂酰神經(jīng)酰胺(dl8: 1/8:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:2)、溶血磷脂酰膽堿(18:1)和磷脂酰肌醇（18:3/0:0)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物，其特征在于:包括任 意三個所述的代謝標(biāo)志物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物，其特征在于:包括任 意四個所述的代謝標(biāo)志物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物，其特征在于:包括任 意五個所述的代謝標(biāo)志物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物，其特征在于:包括全 部七個所述的代謝標(biāo)志物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任一所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物，其特征在 于:所述代謝標(biāo)志物來源于血漿。7. -種定性或定量分析權(quán)利要求1~5任一所述的用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo) 志物的方法，其特征在于:采用液質(zhì)聯(lián)用和/或氣質(zhì)聯(lián)用對所述代謝標(biāo)志物進(jìn)行定性或定量 分析。8. 權(quán)利要求1~5任一所述的代謝標(biāo)志物在篩選治療或緩解急性冠脈綜合征的藥物中 的應(yīng)用。9. 一種用于診斷急性冠脈綜合征的檢測試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求1~5任一 所述的代謝標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為各代謝標(biāo)志物的化學(xué)單體或混合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于:還包括溶解所述標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑和/ 或提取富集所述代謝標(biāo)志物的溶劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于診斷急性冠脈綜合征的代謝標(biāo)志物，包括磷酸膽堿、棕櫚酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿(16:0)、磷脂酰神經(jīng)酰胺(d18:1/8:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:2)、溶血磷脂酰膽堿(18:1)和磷脂酰肌醇(18:3/0:0)中的一個或多個。單個用于診斷區(qū)分急性冠脈綜合征患者和冠狀動脈正常人時，ROC曲線下面積(AUC)均大于0.7，具有臨床診斷意義；聯(lián)合用于診斷時，隨著聯(lián)合個數(shù)的增加，AUC進(jìn)一步提高，7個全部聯(lián)合時最高，AUC達(dá)0.987，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為99.1％和98.9％。本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物能準(zhǔn)確地診斷急性冠脈綜合征，準(zhǔn)確性高，靈敏度和特異性強(qiáng)。
【IPC分類】G01N30/06, G01N30/88
【公開號】CN105486799
【申請?zhí)枴緾N201610051208
【發(fā)明人】李萍, 劉麗偉, 范勇, 齊煉文
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月25日