板內(nèi)液 體，用洗滌緩沖液洗滌5次排干;然后以100μL孔加入以酶標(biāo)抗體1:40000倍稀釋的酶標(biāo)抗 體置37°C溫育30min;取出反應(yīng)板倒掉酶標(biāo)抗體有洗滌緩沖液洗滌5次;顯色液Α、Β等體積混 勻后，以100μL孔加入，37°C溫育lOmin;加入終止液100μL孔，置酶標(biāo)儀上450nm和630nms 雙波段測量各孔0D值，根據(jù)待測樣本（S)，陽性對照（P)和陰性對照（N)的0D450 = 0D450-0D630和PI值=(樣品0D450/陽性對照0D450)x100 %，如果P 2 0 · 6，Ν < 0 · 1 的基礎(chǔ)上PI 2 0 · 2 則判定為陽性。
[0049] 應(yīng)用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行鸚鵡熱衣原體檢測時(shí)采用抗原檢測抗體的酶聯(lián)免疫 吸附方法。應(yīng)用在禽群是否感染鸚鵡熱衣原體病原的分析中，待測樣本為采自禽的血清。
[0050] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0051] 本發(fā)明通過基因工程表達(dá)重組蛋白M0MP，并以此為抗原包被固相載體進(jìn)行酶聯(lián)免 疫吸附檢測。本發(fā)明試劑盒使用基因工程表達(dá)的高純度的重組抗原作為包被抗原，特異性 高，靈敏性好。且在抗原包被固相載體后用抗原保護(hù)劑對包被好的抗原進(jìn)行保護(hù)，延長了抗 原的保存時(shí)間。此外，本發(fā)明使用的酶聯(lián)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗禽IgG，可廣泛 針對禽類，如雞、鴨、鵝等進(jìn)行通用性的檢測。
[0052]本發(fā)明提供的試劑盒能夠彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中對鸚鵡熱衣原體檢測的不足，且ELISA 方法便于操作、所需時(shí)間短、降低操作人員的主觀因素影響。且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，對儀器要求不高， 僅需要普通恒溫水浴箱、酶標(biāo)儀等。本發(fā)明適于作為大規(guī)模商業(yè)檢測方法推廣，具有良好的 市場前景。所述試劑盒也可為禽類鸚鵡熱衣原體病的流行病學(xué)調(diào)查與診斷奠定了新的技術(shù) 基礎(chǔ)，滿足了臨床檢驗(yàn)的需求。
【附圖說明】
[0053] 圖1為本發(fā)明pET-28a-M0MP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化的SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果。 其中：M，蛋白Marker;l，轉(zhuǎn)化pET-28a-M0MP表達(dá)質(zhì)粒的BL21(DE3)誘導(dǎo)后全菌蛋白；2,純化 后的pET-28a-M0MP重組蛋白。
[0054] 圖2為本發(fā)明重組pET-28a-M0MP蛋白的Western-blot鑒定結(jié)果。其中：M，蛋白 Marker; 1，純化的 pET-28a-M0MP 重組蛋白。
[0055] 圖3為本發(fā)明陽性和陰性血清R0C曲線圖。
[0056] 圖4為本發(fā)明R0C曲線的坐標(biāo)點(diǎn)及相應(yīng)的敏感性和1 -特異性。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí) 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0058]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0059] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0060] 實(shí)施例1重組蛋白Μ0ΜΡ的制備
[00611 1、提取鸚鵡熱衣原體6BC株總DNA(DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京）有限 公司）
[0062] 1)取100yL鸚鵡熱衣原體6BC株純化產(chǎn)物，加入200yL緩沖液GA，振蕩混勻。
[0063] 2)加入20yL Proteinase K溶液，振蕩混勻，再加入200yL緩沖液GB，充分顛倒混 勻，70°C放置10min，簡短離心。
[0064] 3)加入200yL無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，此時(shí)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心。
[0065] 4)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0066] 5)向吸附柱CB3中加入500yL緩沖液GD(使用前已加入無水乙醇），12000rpm離心 30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0067] 6)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前已加入無水乙醇），12000rpm離心 30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0068] 7)重復(fù)操作步驟6)。
[0069] 8)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室 溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0070] 9)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附柱膜的中央部位懸空滴加100yL 去離子水(預(yù)熱60°C)，室溫放置5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，-20°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0071] 2、引物設(shè)計(jì)：
[0072] 根據(jù)Genbank上收錄鸚鵡熱衣原體6BC株Μ0ΜΡ基因序列(Accession:CP002549)，利 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成1對Μ0ΜΡ基因（全長1143bp)特異引物M0MP-F和Μ0ΜΡ-R，在上下引物的5 '端分別引入EcoRI和Sal I酶切位點(diǎn)。引物序列如下：
[0073] M0MP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；
[0074] M0MP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；
[0075] 3、PCR擴(kuò)增：以提取的6BC基因組總DNA為模版，用DNA聚合酶擴(kuò)增Μ0ΜΡ序列。擴(kuò)增的 條件參數(shù):預(yù)變性94°C4min后，進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，依次為變性94°C30s，退火60°C45s，延伸72°C 1.20min。共計(jì)35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后補(bǔ)延伸72 °C 7min，終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖膠 電泳檢測，并用膠回收試劑盒(TRANSGEN公司）回收純化。
[0076] 4、重組質(zhì)粒構(gòu)建：
[0077] 回收純化的PCR產(chǎn)物Μ0ΜΡ與pEASY-Tl連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定獲得 重組質(zhì)粒pEASY-Tl-MOMP。用和EcoRI和Sal I雙酶切pEASY-Tl-MOMP并回收Μ0ΜΡ片段，連接到 相同酶切處理的pET_28a( + )載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒pET-28a_ Μ0ΜΡ，構(gòu)建了 pET-28a-M0MP重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0078] 5、重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)和純化：
[0079] 1)將構(gòu)建的pET-28a-M0MP重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，37°C搖床培 養(yǎng)至0D0.8，用0.5mM IPTG于37°C誘導(dǎo)4小時(shí)。然后離心收集菌體，懸浮于PBS溶液中，超聲裂 解，離心收集沉淀，次步驟重復(fù)2次。
[0080] 2)將超聲、離心后收集的沉淀重新懸浮于10mL 8mol/L尿素溶液中，時(shí)，隨后將以 細(xì)胞破碎儀破碎菌體，功率為300W，超聲時(shí)間5s，間隔時(shí)間10S，共超聲80次。裂解后的菌液 于4°C10000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至透析袋中，依次放入2mol/L尿素溶液中，置于4°C 透析復(fù)性48小時(shí)。最后將透析袋放入1L pH8.020mmol/L的Tris-HCL溶液中繼續(xù)透析48小 時(shí)，期間換3次液，收集透析袋中的蛋白液，為粗純蛋白。按著Invitrogen Ni-NTA瓊脂糖樹 脂說明書進(jìn)行純化優(yōu)化純化條件。優(yōu)化后的條件為：
[0081 ] 3) lmL純化柱用20mL含有5mM咪唑的PBS進(jìn)行平衡，控制流速lmL/s;
[0082] 4)將1 OmL粗純的重組蛋白與lmL平衡好的NI-NTA瓊脂糖樹脂混合置于4 °C結(jié)合1小 時(shí)；
[0083] 5)將粗純蛋白和Ni-NTA樹脂的混合物倒入直徑1 cm的空柱子內(nèi)，控制流速lmL/s;
[0084] 6)用三分之二柱體積的含20mM咪唑的PBS洗滌柱子2遍，每次流速控制在lmL/s;
[0085] 7)用6mL含有250mM咪唑的roS洗脫與NI-NTA樹脂結(jié)合的目的蛋白，每lmL收集到1 個(gè)EP管中；
[0086] 8)收集好的洗脫液每管取10yL，進(jìn)行15 % SDS-PAGE電泳分析純度，并把蛋白條帶 比較粗純度較高的收集管內(nèi)蛋白溶液收集在一起；
[0087] 9)收集在一起的純化蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，在20倍體積的pH7.2的PBS溶液中透 析72小時(shí)，期間換3次透析緩沖液，透析完成的蛋白和純化前的蛋白進(jìn)行15 % SDS-PAGE電泳 分析純化效果如圖1所示，純化后的重組蛋白大小為43kDa，即得到純化好的重組Μ0ΜΡ蛋白； [0088] 10)純化蛋白以禽嬰4鵡熱衣原體陽性血清進(jìn)行Western-blot檢測，結(jié)果只有一條 43Kda大小的條帶如圖2所示這與重組Μ0ΜΡ蛋白理論大小相符，從此結(jié)果可以確定純化獲得 的蛋白為禽鸚鵡熱衣原體重組Μ0ΜΡ蛋白。
[0089] 11)定蛋白含量分裝，冷凍抽干后-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0090] 實(shí)施例2抗原保護(hù)劑的選擇
[0091]選擇-蔗糖、海藻糖、β_1，3/1，6葡聚糖、