測：用該試劑盒檢測了經(jīng)實施例1中的引物對M0MP-F/M0MP-R做了PCR 鑒定證明均為陽性的92份感染鸚鵡熱衣原體的SPF雞喉頭拭子，判斷。靈敏度以真陽性率表 示，即靈敏度（％) =[陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))]x 100%。
[0145] 2、特異性檢測：用該試劑盒檢測了經(jīng)實施例1中的引物對M0MP-F/M0MP-R做了PCR 鑒定證明均為陰性的92份SPF雞血清，判斷。特異性以真陰性率表示，即特異性（％ )=[陰性 數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))]x 100%。檢測結(jié)果如下：
[0146]
[0147] 注"+"代表陽性；代表陰性。
[0148] 3、92份由PCR檢測陽性的樣品，ELI SA試劑盒檢出88份陽性，4份陰性;92份由PCR檢 測陰性的樣品，ELISA試劑盒檢出0份陽性，92份陰性。用SPSS軟件對兩種方法的做X2檢驗 (McNemar Test)，P>0.05,表明兩種方法沒有顯著差別，同時初步得出本試劑盒的靈敏度 為95.7.3%，特異性為100%。
[0149] 實施例9重復(fù)性檢測
[0150] 按照ELISA操作方法，以同一試劑盒對8份禽血清(4份陰性，4份陽性)各重復(fù)測定3 次；同時，用同一批不同試劑盒和不同批次的試劑盒分別對8份禽血清進(jìn)行重復(fù)檢測各3次， 計算其各自0D450的平均值，按照CV(%) = (SD/AV 0D450)x100 %計算該ELISA試劑盒的板 內(nèi)、批內(nèi)和批間變異系數(shù)CV值，驗證該ELISA試劑盒的重復(fù)性。檢測結(jié)果如下：
[0151]
[0152] ELISA試劑盒板內(nèi)和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，批間變異系數(shù)均小于15%。
[0153] 實施例10禽衣原體病酶聯(lián)免疫抗體檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)體系的建立
[0154] 1、臨界值的建立:根據(jù)優(yōu)化確立的ELISA試驗條件，檢測146份人工感染的鸚鵡熱 衣原體陽性血清和108份SPF雞陰性血清進(jìn)行檢測，計算各血清的0D450與陽性對照0D450的 比值PI，以1-特異性為橫坐標(biāo)，敏感度為縱坐標(biāo)，運(yùn)用SPSS 20.0軟件繪制R0C曲線，統(tǒng)計尤 登指數(shù)(Youden's Index，YI)，YI =敏感性+特異性-1，選擇尤登指數(shù)最大處為最佳臨界點， 此點對應(yīng)的敏感性和特異性最高，確定該處的PI值為試劑盒臨界值(CUT-OFF值）。如圖3和 圖4所示，經(jīng)SPSS20.0軟件繪制得到R0C曲線，曲線下面積=0.975，尤登指數(shù)最大值= 0.837，此點對應(yīng)的靈敏性為0.911，特異性為0.926，對應(yīng)坐標(biāo)點為PI = 16.975。該方法變異 系數(shù)約為15%，故確定該試劑盒的⑶T-0FF值PI = 20%。
[0155] 2、檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：待測樣本（S)，陽性對照（P)和陰性對照（N)的0D450 = 0D450-0D630和PI值=(樣品0D450/陽性對照0D450)x100 %，如果P 2 0.6，N < 0.1則試劑盒 有效。在此基礎(chǔ)上PI 2 20%則判定為衣原體陽性。PI <20%則判定為衣原體陰性。
[0156] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種酶聯(lián)免疫檢測禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:包被有 鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP的固相載體，酶標(biāo)抗體，禽鸚鵡熱衣原體陰性對照血清，禽鸚鵡 熱衣原體陽性對照血清； 所述鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體包被鸚鵡熱衣原體重組蛋 白MOMP后，經(jīng)抗原保護(hù)劑處理，所述抗原保護(hù)劑含有2 %的β-l，3/1，6葡聚糖，20 %的甘油和 0.01%的明膠，余量為PBS。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為酶標(biāo)板，包被有鸚鵡熱 衣原體重組蛋白MOMP的酶標(biāo)板的制備方法為： 1) 以鸚鵡熱衣原體6BC株總DNA為模板，使用特異性引物M0MP-F和M0MP-R進(jìn)行擴(kuò)增； M0MP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC； M0MP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG； 2) 將擴(kuò)增所得片段回收純化后用EcoRlI和Sail雙酶切回收純化目的片段； 3) 將酶切好的目的片段與用相同酶切的PET28a( + )載體連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒； 4) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)內(nèi)，37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； 5) 將菌液離心收集沉淀，將沉淀重溶于pH7.2的roS溶液中，經(jīng)過超聲裂解處理后離心 取沉淀。 6) 重復(fù)第5)步，獲得的沉淀即為重組蛋白包涵體； 7) 將步驟6)的沉淀經(jīng)尿素溶解、透析復(fù)性后，與Ni-NTA瓊脂糖凝膠混勻，低溫結(jié)合； 8) 將結(jié)合完畢后的蛋白與Ni-NTA瓊脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪唑溶 液洗滌，除去雜蛋白； 9) 以250mmol/L的咪唑溶液洗脫Ni-NTA柱，收集經(jīng)SDS-PAGE分析達(dá)到95%以上純化程 度的重組蛋白MOMP洗脫液； 10) 將收集的蛋白洗脫液體裝入透析袋中，在20倍體積的PBS溶液中透析去除咪唑，冷 凍抽干獲得干粉重組蛋白MOMP; 11) 將重組蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸鹽緩沖液稀釋為終濃度0.5yg/mL，加入酶標(biāo)板 各孔，4°C孵育16小時，用洗滌緩沖液PBST沖洗酶標(biāo)板，再用封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST 溶液)封閉，倒掉封閉液，洗滌，甩干； 12) 封閉好的微孔板每孔加入200微升的抗原保護(hù)劑，pH7.2溶液37°C孵育4小時后，倒 掉抗原保護(hù)劑，洗滌，甩干，晾干，即獲得包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP的酶標(biāo)板。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)抗體為辣根過氧化 物酶標(biāo)記的兔抗禽IgG。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述禽鸚鵡熱衣原體陽性對照血清的制 備方法為： 取鸚鵡熱衣原體6BC株滅活抗原，將抗原以2SP溶液稀釋至蛋白濃度為2mg/mL; 選擇8周齡，衣原體抗體為陰性SPF雞，進(jìn)行免疫； 首免:將氟氏完全佐劑與衣原體抗原等量混合，充分乳化，取lmL頸部皮下多點注射； 二免:首免后第14天，取氟氏不完全佐劑與衣原體抗原等量混合，充分乳化，取lmL頸部 皮下多點注射； 三免:二免后第7天，同二免方法加強(qiáng)免疫一次； 四免:三免后第7天，肌肉和頸部皮下各注射衣原體抗原lmL; 1周后采血，經(jīng)衣原體IHA試劑盒測定血清抗體效價，選取效價2 1: 256的SPF雞，進(jìn)行心 臟采血，無菌分離血清，水浴滅活，即獲得禽鸚鵡熱衣原體陽性對照血清。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述禽鸚鵡熱衣原體陰性對照血清的制 備方法為： 選取2~4只SPF雞，優(yōu)選2只，分別采血、分離血清，水浴滅活，經(jīng)過衣原體間接血凝 (IHA)試劑盒檢測，收集結(jié)果為陰性的禽血清，混合，即為禽鸚鵡熱衣原體陰性對照血清。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括洗滌緩沖液、酶標(biāo) 抗體稀釋溶液、樣本稀釋緩沖液、顯色液和終止液。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌緩沖液為含0.5%。吐溫-20、 pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBST); 所述酶標(biāo)抗體稀釋溶液為含有1. 〇 %牛血清白蛋白、〇. 1%。硫柳汞鈉、5 %甘油、5 %海藻 糖的pH7.2的磷酸鹽緩沖液； 所述樣本稀釋緩沖液為含有1 %小牛血清、〇 . 3 % Tri ton-100、0.1%。硫柳汞鈉的pH7.2 的磷酸鹽緩沖液； 所述終止液為強(qiáng)酸。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述終止液為蒸餾水配制的出504。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，所述顯色液包括顯色劑A和顯色劑 B:顯色劑A為含1.46 %磷酸氫二鈉，0.93 %梓檬酸，0.045 %過氧化氫的水溶液；顯色劑B為 含0.03%四甲基聯(lián)苯胺，0.096%檸檬酸，0.019%乙二胺四乙二酸鈉鹽，2%DMSO,4%甘油 的水溶液。
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測試劑盒，具體公開了酶聯(lián)免疫檢測禽鸚鵡熱衣原體的試劑盒。本發(fā)明通過基因工程表達(dá)重組蛋白MOMP，并以此為抗原包被固相載體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附檢測。本發(fā)明試劑盒使用基因工程表達(dá)的高純度的重組抗原作為包被抗原，特異性高，靈敏性好。且在抗原包被固相載體后用抗原保護(hù)劑對包被好的抗原進(jìn)行保護(hù)，延長了抗原的保存時間。此外，本發(fā)明使用的酶聯(lián)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗禽IgG，可廣泛針對禽類，如雞、鴨、鵝等進(jìn)行通用性的檢測。
【IPC分類】G01N33/569, G01N33/68, G01N33/543
【公開號】CN105606826
【申請?zhí)枴緾N201610082031
【發(fā)明人】何誠, 吳宗學(xué), 張強(qiáng)
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年2月5日