脂蛋白磷脂酶a2免疫層析定量檢測(cè)試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種高靈敏度脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測(cè)試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]脂蛋白磷脂酶A2 (Lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp_PLA2)是磷醋酶A2 (phospholipase A2，PLA2)超家族中的一員，由441個(gè)氨基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶，相對(duì)分子質(zhì)量為45.4kD。Lp-PLA2作為一種新的炎性反應(yīng)標(biāo)志物，在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的幾個(gè)主要階段中均起著作用。
[0003]Lp-PLA2主要由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在早期的關(guān)于Lp_PLA2與As的研宄中因Lp_PLA2能水解致炎因子如血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)及結(jié)構(gòu)相關(guān)的氧化磷脂，因此曾被認(rèn)為能抑制炎性反應(yīng)，甚至能抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成，故也被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor acetylhydrolase，PAF-AH)。但是近年來(lái)的研宄已證實(shí)Lp-PLA2更大的作用在于促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生與發(fā)展。
[0004]目前，關(guān)于Lp-PLA2的實(shí)驗(yàn)研宄及流行病學(xué)研宄已經(jīng)表明，Lp_PLA2具有促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的作用，是一個(gè)新的AS的危險(xiǎn)標(biāo)志物，能獨(dú)立預(yù)測(cè)AS的風(fēng)險(xiǎn)，在未來(lái)的臨床決策中可能成為一個(gè)獨(dú)立的測(cè)量指標(biāo)。
[0005]目前檢測(cè)脂蛋白磷脂酶A2的常用方法有:
[0006]I酶聯(lián)免疫吸附法
[0007]酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體特異性結(jié)合與酶底物的高效催化產(chǎn)物作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。利用Lp-PLA2抗原性制備特異性抗體，通過(guò)免疫學(xué)方法直接測(cè)定血液中酶的蛋白質(zhì)含量。
[0008]2免疫透射比濁法
[0009]免疫透射比濁法是實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)方法。免疫透射比濁法也是一種微量的免疫沉淀測(cè)定法。其與速率散射比濁法不同的是以測(cè)定透過(guò)溶液的光量來(lái)反映待測(cè)抗原的含量。當(dāng)光線透過(guò)反應(yīng)體系時(shí)，溶液中的抗原抗體免疫復(fù)合物可對(duì)光線加以吸收和反射，使透射光減少。免疫復(fù)合物越多，吸收的光線越多，透射光越少，這種變化可用吸光度表示。若抗體量固定，所測(cè)吸光度與免疫復(fù)合物的量成正比，也與待測(cè)抗原的量成正比。以一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可以測(cè)出受檢物含量。
[0010]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問(wèn)世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。將該系統(tǒng)應(yīng)用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測(cè)技術(shù)中，可顯著地提高以上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡(jiǎn)便，有助于臨床快速診斷，并利于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，成為研宄免疫反應(yīng)的有力工具。由于BAS檢測(cè)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速，又無(wú)放射物質(zhì)污染，不需復(fù)雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應(yīng)用的可能性。
[0011]生物素-親和素系統(tǒng)檢測(cè)原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測(cè)系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價(jià)鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級(jí)放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測(cè)未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個(gè)生物素，因幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制脂蛋白磷脂酶A2檢測(cè)試快速診斷試劑尚無(wú)報(bào)道。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0012]本實(shí)用新型的目的，在于提供一種脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測(cè)試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測(cè)試紙條。使用本實(shí)用新型時(shí)，提高了檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，檢測(cè)時(shí)間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0013]本實(shí)用新型解決其技術(shù)問(wèn)題的解決方案是:脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測(cè)試紙條，其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標(biāo)記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測(cè)區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊上固定有生物素標(biāo)記的脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體和鏈霉親和素標(biāo)記的熒光蛋白；所述檢測(cè)區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識(shí)別脂蛋白磷脂酶A2另外一個(gè)表位的單克隆抗體構(gòu)成的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0014]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光標(biāo)記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊和第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標(biāo)記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0015]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述第一熒光標(biāo)記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
[0016]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對(duì)應(yīng)于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對(duì)應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
[0017]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述觀察窗為長(zhǎng)方形孔。
[0018]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0019]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0020]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0021]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0022]本實(shí)用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0023](I)本實(shí)用新型將熒光蛋白作為標(biāo)記物，此標(biāo)記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測(cè)穩(wěn)定性。
[0024](2)本實(shí)用新型通過(guò)利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測(cè)靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0025](3)利用本實(shí)用新型進(jìn)行降鈣素原的檢測(cè)時(shí)間不大于10分鐘，檢測(cè)線性范圍為
0.10ng/ml?100.00ng/ml，極大地提高了檢測(cè)效率。
[0026](4)本實(shí)用新型可通過(guò)熒光免疫分析儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結(jié)果。
[0027](5)本使用新型卡殼設(shè)有樣品進(jìn)入的加樣孔和供觀測(cè)結(jié)果的觀察窗，根據(jù)分析儀器判定結(jié)果，準(zhǔn)確可靠。
[0028](6)本實(shí)用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0029](7)本實(shí)用新型檢測(cè)成本較低。
[0030](8)本實(shí)用新型可批量生產(chǎn)，適用于臨床快速診斷和現(xiàn)場(chǎng)快速診斷；易于保存，有利于基層單位推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0031]為了更清楚地說(shuō)明本實(shí)用新型實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單說(shuō)明。顯然，所描述的附圖只是本實(shí)用新型的一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他設(shè)計(jì)方案和附圖。
[0032]圖1是本實(shí)用新型實(shí)施例一的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033]圖2是本實(shí)用新型實(shí)施例二的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034]圖3是本實(shí)用新型實(shí)施例三的結(jié)構(gòu)示意圖；