本發(fā)明涉及基因表達譜分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用mRNA表達譜與競爭性內(nèi)源RNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因的方法。

背景技術(shù)：

中國所有浸潤性乳腺癌患者中大約81.4％接受了輔助化療并有較高腫瘤治愈率。然而，乳腺癌患者長期存活者目前存在的問題：心臟原因引起的死亡率增高8.2倍；長期存活的患者發(fā)生心衰的風(fēng)險性高15倍，心血管疾病發(fā)生風(fēng)險高10倍。2015年NCCN乳腺癌指南首選輔助化療方案AC×4→T(P)×4(吡柔比星/環(huán)磷酰胺-紫杉醇)，蒽環(huán)類因其抗瘤譜廣、抗瘤活性強，在腫瘤化療中獲得較高評價。該類藥物最突出的化療毒副反應(yīng)為心臟毒性(Anthracycline-Induced Cardiotoxicity，AIC)，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的急性、慢性、遲發(fā)性心肌毒性。蒽環(huán)類藥物沒有絕對的“安全劑量”，可能是因為存在著個體差異，即患者體內(nèi)代謝蒽環(huán)類藥物相關(guān)基因的差異性導(dǎo)致其對蒽環(huán)類藥物的易感性不同。蒽環(huán)類藥物的心臟毒性臨床治療困難，療效不理想，重點在于早期檢測，積極預(yù)防。

目前，蒽環(huán)類藥物心臟毒性的防治手段包括：

心內(nèi)膜心肌活檢(EMB)，其是一種評估蒽環(huán)類心臟毒性最敏感、最特異的方法，但是因為是有創(chuàng)性檢查和技術(shù)要求高，臨床應(yīng)用受到極大的限制；

無創(chuàng)性監(jiān)測，其廣泛應(yīng)用于臨床，主要是用于監(jiān)測心功能變化，如超聲心動圖和MUGA等。但是，無創(chuàng)性監(jiān)測通常只能在較為晚期階段檢測出心臟毒性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術(shù)中蒽環(huán)類藥物的心臟毒性的無創(chuàng)性監(jiān)測只能在較為晚期階段檢測出，導(dǎo)致臨床治療困難，療效不理想的技術(shù)問題，提供一種利用mRNA表達譜與競爭性內(nèi)源RNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

一種利用mRNA表達譜與競爭性內(nèi)源RNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因的方法，包括以下步驟：

步驟1、通過mRNA和競爭性內(nèi)源RNA表達譜芯片檢測到大量基因的表達值，對所有基因的相關(guān)性進行排序，去除在所有樣本中表達量RPKM均值小于1的低相關(guān)度基因，留下與蒽環(huán)類藥物心臟毒性分類RPKM均值1以上的密切相關(guān)的基因；

步驟2、將獲取的mRNA和競爭性內(nèi)源RNA特征基因進行合并，形成基因池；

步驟3、通過遺傳算法，對所述基因池進一步選擇基因，消除冗余基因，搜索獲得一個最優(yōu)特征的最優(yōu)基因集；

步驟4、通過比較乳腺癌患者、乳腺癌AIC患者及正常人mRNA與競爭性內(nèi)源RNA聯(lián)合表達譜不同，樣本間的數(shù)據(jù)從而選出差異表達的基因；基于差異表達基因進行分析；

步驟5、對差異表達基因預(yù)測，挑選score大于140，自由能小于-20的作為可靠的靶基因；再從靶基因中挑選P值小于0.05的，用剩余部分RNA對構(gòu)建的乳腺癌蒽環(huán)類藥物心臟毒性發(fā)病目的靶基因進行驗證。

在上述技術(shù)方案中，步驟1中對所有基因的相關(guān)性進行排序的方法具體為采用過濾式特征基因選擇方法：分別去除mRNA和競爭性內(nèi)源RNA表達譜芯片中1000～2000個低相關(guān)度基因，留下100～200個與蒽環(huán)類藥物心臟毒性分類密切相關(guān)的基因，分別在mRNA和競爭性內(nèi)源RNA表達譜中選取得分最高的10～50個基因。

在上述技術(shù)方案中，步驟3中的所述最優(yōu)基因集具有1～10個的基因數(shù)量。

在上述技術(shù)方案中，步驟4中基于差異表達基因進行的分析具體包括：差異基因表達模式聚類分析，Gene Ontology功能顯著性富集分析，Pathway顯著性富集分析，以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。

在上述技術(shù)方案中，所述競爭性內(nèi)源RNA為miRNA、lncRNA或者cirRNA。

本發(fā)明具有以下的有益效果：

本發(fā)明的利用mRNA表達譜與競爭性內(nèi)源RNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因的方法，聯(lián)合mRNA表達譜和競爭性內(nèi)源RNA表達譜芯片篩選蒽環(huán)類藥物給藥前、后罹患心臟毒性的基因表達譜，候選出更為可靠的與蒽環(huán)類藥物心臟毒性相關(guān)的潛在基因標(biāo)志物。從多層面、多角度揭示蒽環(huán)類藥物心臟毒性的分子生物學(xué)改變的缺陷，對理解蒽環(huán)類藥物心臟毒性發(fā)生、發(fā)展機制以及研發(fā)診斷、判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)起到很大幫助，充分發(fā)揮了有效的作用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。

圖1為本發(fā)明的利用mRNA表達譜與競爭性內(nèi)源RNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因的方法的步驟示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做以詳細(xì)說明。

本發(fā)明的利用mRNA表達譜與競爭性內(nèi)源RNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因的方法，以利用mRNA表達譜與miRNA表達譜為例，包括以下的步驟：

一.外周血的采集及mRNA基因表達譜和miRNA基因表達譜的獲得

1.對象

2016年1月-2016年12月在某院腫瘤科收集應(yīng)用化療前且未出現(xiàn)心臟毒性乳腺癌患者及應(yīng)用蒽環(huán)類藥物后出現(xiàn)心臟毒性患者的血清標(biāo)本各6例，同期收集10例健康志愿者作為對照(其中每組3人提取的總RNA標(biāo)本用于測序檢測外周血單個核細(xì)胞基因表達譜和miRNA表達譜，其余人用于目的基因qPCR驗證)。3組研究對象間性別、年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。

蒽環(huán)類藥物心臟毒性評價標(biāo)準(zhǔn)：指具有下面的一項或多項表現(xiàn)，但不包含化療/靶向藥物使用早期發(fā)生的亞臨床的心血管損傷：(1)左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)降低的心肌病，表現(xiàn)為整體功能降低或室間隔運動明顯降低；(2)充血性心衰(CHF)相關(guān)的癥狀；(3)CHF相關(guān)的體征，如第3心音奔馬律、心動過速，或兩者都有；(4)LVEF較基線降低至少5％至絕對值＜55％，伴隨CHF的癥狀或體征；或LVEF降低至少10％至絕對值＜55％，未伴有癥狀或體征[J Clin Oncol，2002，20:1215-1221.]。

2.外周靜脈血采集

每天上午8-9點間使用EDTA抗凝管采集受試者10mL外周血，于10分鐘之內(nèi)送往實驗室處理。

3.RNA提取

按miRNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取和純化外周血單個核細(xì)胞RNA。

4.獲得mRNA基因表達譜

上述樣本Total RNA質(zhì)控，分別用不同的紅、綠熒光基團標(biāo)記，芯片雜交，經(jīng)過洗脫后，熒光掃描，通過專用的圖像分析軟件，可獲得微陣列上每個點的紅、綠熒光強度(Cy5和Cy3)，其比值(Cy5/Cy3)稱為基因在不同樣本中的表達水平。

5.獲得miRNA基因表達譜

與上述步驟4相同，這里不再贅述。

二.利用mRNA表達譜與miRNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因，該方法包括以下步驟：

步驟1、通過mRNA和miRNA表達譜芯片檢測到大量基因的表達值，采用過濾式特征基因選擇方法對所有基因的相關(guān)性進行排序，去除大量的低相關(guān)度基因，留下少量與蒽環(huán)類藥物心臟毒性分類密切相關(guān)的基因；

通過過濾式特征基因選擇方法的選擇實施，分別去除mRNA和miRNA表達譜芯片中大量的(1000～2000個)低相關(guān)度基因，留下少量(100～200個)與蒽環(huán)類藥物心臟毒性分類RPKM均值1以上的密切相關(guān)的基因，分別在mRNA和miRNA表達譜中選取得分最高的n(10～50)個基因；

步驟2、將采用過濾式特征基因選擇方法獲取的mRNA和miRNA特征基因進行合并，形成基因池U；

步驟3、通過遺傳算法，對基因池進一步選擇基因，消除冗余基因，搜索獲得一個最優(yōu)特征的最優(yōu)基因集S，使其具有更少(1～10個)的基因數(shù)量和更好的分類性能；

步驟4、通過比較乳腺癌患者、乳腺癌AIC患者及正常人mRNA與miRNA聯(lián)合表達譜不同，樣本間的數(shù)據(jù)從而選出差異表達的基因；最后基于差異表達基因，進行差異基因表達模式聚類分析，Gene Ontology功能顯著性富集分析，Pathway顯著性富集分析，以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析；

步驟5、對差異表達基因預(yù)測，挑選score大于140，自由能小于-20的作為可靠的靶基因；再從靶基因中挑選P值小于0.05的，由于我們采用同一RNA樣本同時進行基因表達譜和miRNA表達譜研究，獲得的基因集既包含mRNA基因，又包含miRNA基因，因此，這些差異表達的靶基因和差異表達的miRNA被認(rèn)為是有調(diào)控關(guān)系的；用剩余部分RNA對構(gòu)建的乳腺癌蒽環(huán)類藥物心臟毒性發(fā)病目的靶基因進行驗證。

在上述具體實施方式中提到的miRNA，其含義與microRNA或者miRNAs或者microRNAs含義相同，均為一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA。mRNA的含義為信使RNA。

RPKM是Reads Per Kilo bases per Million reads的縮寫，代表每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)。

基因冗余gene redundancy是指：編碼同一物質(zhì)的基因出現(xiàn)重復(fù)的現(xiàn)象，如在E.coli中的染色體中有兩到多倍的tRNA基因的現(xiàn)象。

在本發(fā)明的具體實施方式中，差異基因表達模式聚類分析，Gene Ontology功能顯著性富集分析，Pathway顯著性富集分析，以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析等分析手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的普通分析手段，這里不再贅述。

在其他的具體實施方式中，競爭性內(nèi)源RNA還可以是lncRNA或者cirRNA，利用mRNA表達譜與lncRNA表達譜，或者利用mRNA表達譜與cirRNA表達譜聯(lián)合篩選蒽環(huán)類藥物心臟毒性基因的方法與上述具體實施例類似，這里不再贅述。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。