本發(fā)明涉及藥物設(shè)計(jì)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型及其建立方法。
背景技術(shù)：
：良性前列腺增生(benignprostatichyperplasia，bph)以前列腺肥大和前列腺平滑肌收縮異常為典型特征：一方面，前列腺腺體肥大導(dǎo)致尿道受壓迫和膀胱尿流阻滯；另一方面，交感神經(jīng)系統(tǒng)通過α1-腎上腺素受體(adrenoceptors，ars)影響膀胱頸和前列腺平滑肌引起異常收縮。早期，臨床上使用抑制劑拮抗α1-ar，使bph患者減低尿道內(nèi)壓和提高尿流速率，已被證明是有效的。經(jīng)典拮抗劑如prazosin、terazosin、doxazosin和alfuzosin等，在用于治療bph初期取得了較好的療效。然而，由于這類拮抗劑對α1-ar非亞型選擇性拮抗，患者服用該類藥物后易產(chǎn)生心血管副作用(體位性低血壓、頭暈、疲勞和虛弱乏力等)。α1-ar受體可分為三種亞型(α1a，α1b和α1d-ar)，在前列腺組織中以α1a和α1d-ar分布為主，α1b-ar分布極少。隨著bph患者前列腺基質(zhì)比增加，α1a-ar所占的比例明顯增高。拮抗α1a-ar可緩解尿路梗阻，拮抗α1d-ar可改善逼尿肌功能失調(diào)的刺激性和灌注性排泄癥等由bph引起的下尿路癥狀。α1b-ar主要表達(dá)于血管床，主要調(diào)節(jié)小阻力血管，收縮海綿體，保持血管狀態(tài)，是有效緩解性功能勃起障礙的靶標(biāo)。拮抗劑對α1b-ar的選擇性抑制已證實(shí)是產(chǎn)生血管副作用的根本原因。近年來，α1-ar拮抗劑的研究動(dòng)態(tài)強(qiáng)化了對其亞型選擇性的要求。選擇性抑制α1a/d-ar而對α1b-ar不抑制或抑制較弱，能有效減輕尿道內(nèi)壓和提高尿流速率等前列腺增生引發(fā)的一系列下尿路癥狀，明顯減低心血管副作用。如何設(shè)計(jì)和研究α1a/d-ar選擇性拮抗劑是當(dāng)今治療bph而減低副作用的關(guān)鍵。近年來，國際上對于α1-ar拮抗劑的研究成果體現(xiàn)了拮抗劑亞型選擇性細(xì)化分類的導(dǎo)向。如經(jīng)典拮抗α1a-ar亞型的snap-5089和silodosin、拮抗α1b-ar亞型的(+)-胞磷膽堿和l-765314、以及拮抗α1d-ar亞型的bmy-7378等。已報(bào)道多個(gè)系列α1-ar拮抗劑的合成強(qiáng)調(diào)了α1a/d-ar選擇性。對于靶向合適的α1a/d-ar亞型選擇度作為bph藥物的研究還是差強(qiáng)人意。已上市的具有高選擇性的α1-ar拮抗劑品種仍較少，臨床上用于治療bph較多的還是亞型選擇性差的prazosin、tamsulosin和silodosin等。α1-ar選擇性拮抗劑研究作為bph藥物，有效治療bph且低心血管副作用風(fēng)險(xiǎn)需要具備以下三個(gè)特征：①對α1b-ar不拮抗或拮抗性弱；②具有α1a/1d-ar拮抗；③對α1a-ar和α1d-ar分別具有特定的拮抗度。其中，特征③合適的α1a/1d-ar選擇度是拮抗劑靶向治bph保效低副作用的關(guān)鍵。α1-ar是g蛋白偶聯(lián)受體家族的重要成員，盡管目前已從序列上對其亞型進(jìn)行了準(zhǔn)確的區(qū)分，然而α1-ar的三維蛋白晶體結(jié)構(gòu)仍尚未得到，為了準(zhǔn)確的研究靶點(diǎn)和拮抗劑的構(gòu)效關(guān)系，就需要建立合理的理論模型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了一種α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型的建立方法，包括如下步驟：以α1-ar亞型蛋白的氨基酸序列為探針，搜索蛋白晶體數(shù)據(jù)庫，得到同源模板；通過氨基酸序列比對，使用的prime模塊對α1-ar亞型蛋白進(jìn)行同源模建；采用的macromodel模塊對同源模建得到的蛋白進(jìn)行優(yōu)化，得到α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型。優(yōu)選地，α1-ar亞型蛋白包括α1a-ar，α1b-ar和α1d-ar。優(yōu)選地，搜索蛋白晶體數(shù)據(jù)庫是采用proteinblast程序搜索。優(yōu)選地，同源模板為蛋白β2-ar。β2-ar蛋白id為2rh1，其是最合適的同源模板。優(yōu)選地，在氨基酸序列比對之后，同源模建之前，去除所述蛋白β2-ar中的t4l區(qū)域。優(yōu)選地，優(yōu)化包括：固定主鏈，在模擬的辛醇環(huán)境中優(yōu)化側(cè)鏈500步；固定側(cè)鏈，在模擬的辛醇環(huán)境中優(yōu)化主鏈500步；在模擬的辛醇環(huán)境中全局優(yōu)化500步。本發(fā)明保護(hù)采用上述α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型的建立方法得到的α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型。本發(fā)明保護(hù)上述α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型的評價(jià)方法：采用procheck對模型的生理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行評估分析，得到的ramachandranplot圖中超過90％的氨基酸位于核心區(qū)域，則符合離體化學(xué)能量規(guī)則。本發(fā)明還保護(hù)采用上述α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型，根據(jù)gpcr的普遍結(jié)合口袋所處的位置，模建α1-ar三個(gè)亞型α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar可能的結(jié)合口袋，并找到α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar三個(gè)亞型關(guān)鍵殘基。優(yōu)選地，所述α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar三個(gè)亞型的關(guān)鍵殘基包括：在193位的氨基酸殘基分別為ile193、val193和ile193，在293位的氨基酸殘基分別為met293、leu293和leu293，在302位的氨基酸分別為lys302、leu302和leu302。本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有如下的有益效果：(1)α1-ar(α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar)是g蛋白偶聯(lián)受體家族的重要成員，盡管目前已從序列上對其亞型進(jìn)行了準(zhǔn)確的區(qū)分，然而α1-ar的三維蛋白晶體結(jié)構(gòu)仍尚未得到，本發(fā)明提供了α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar的模型構(gòu)象，為準(zhǔn)確的研究靶點(diǎn)和拮抗劑的構(gòu)效關(guān)系提供了基礎(chǔ)；(2)本發(fā)明提供的α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar的模型構(gòu)象的建立方法，為建立α1-ar模型構(gòu)象提供了可靠的建立方法；(3)本發(fā)明根據(jù)gpcr的普遍結(jié)合口袋所處的位置，模建了α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar可能的結(jié)合口袋，并找到關(guān)鍵殘基，為解釋α1-ar亞型選擇性拮抗劑的選擇度提供了理論依據(jù)。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例一中的α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar的模型構(gòu)象圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例二中的α1a-ar的ramachandranplot圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例二中的α1b-ar的ramachandranplot圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例二中的α1d-ar的ramachandranplot圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例二中的α1a-ar的profile-3d圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例二中的α1b-ar的profile-3d圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例二中的α1d-ar的profile-3d圖；圖8為本發(fā)明實(shí)施例三中的α1a-ar的活性口袋周圍重要的氨基酸殘基；圖9為本發(fā)明實(shí)施例三中的α1b-ar的活性口袋周圍重要的氨基酸殘基；圖10為本發(fā)明實(shí)施例三中的α1d-ar的活性口袋周圍重要的氨基酸殘基。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只是作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例一本實(shí)施例提供一種α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型及其建立方法，建立方法包括如下步驟：s1：以α1-ar亞型蛋白α1a-ar，α1b-ar和α1d-ar的氨基酸序列為探針，采用proteinblast程序搜索蛋白晶體數(shù)據(jù)庫，得到同源模板蛋白β2-ar(編號：2rh1)；通過swiss-prot(http://www.uniprot.org/)獲取α1腎上腺素受體(α1-ar)三個(gè)亞型(α1a-ar、α1b-ar、α1d-ar)的氨基酸序列，swiss-prot序列號分別為：p35348、p35368和p25100。2rh1是β2腎上腺素受體，與所要建模的α1腎上腺素受體均為gpcr受體a家族中的一員；而且β2腎上腺素受體是研究gpcr的重要模板，它與所要建模的α1腎上腺素受同屬于腎上腺素受體家族，它與α1腎上腺素受體的三個(gè)亞型具有較高的打分和同源率(見表1)，因此，本發(fā)明選用2rh1為建模的模板。表1α1腎上腺素受體的三個(gè)亞型與2rh1序列比對結(jié)果maxscoretotalscorequerycoveryevalueidentp353481422210.66e-370.36p353681502190.613e-390.35p251001542250.482e-400.38s2：通過氨基酸序列比對，去除蛋白β2-ar中的t4l區(qū)域和輔助結(jié)晶的分子結(jié)構(gòu)，使用的prime模塊對α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar，α1b-ar和α1d-ar進(jìn)行同源模建，分別得到三個(gè)結(jié)構(gòu)；在建模之前，首先對2rh1進(jìn)行了準(zhǔn)備，其中包括去除2rh1中用于幫助結(jié)晶的小分子，去除用于提高蛋白熱穩(wěn)定性的t4l。需要說明的是，在接下來模建α1腎上腺素受體的三個(gè)亞型的過程中icl3loop區(qū)域?qū)o法模建(icl3loop區(qū)域的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，目前沒有明確的晶體結(jié)構(gòu)來解釋icl3loop區(qū)域)。根據(jù)序列比對結(jié)果，α1腎上腺素受體三個(gè)亞型與2rh1同源性較高，而且家族保守性殘基均匹配正確，其中包括三號螺旋的“dry”區(qū)域，七號螺旋的“npxxy”區(qū)域，六號螺旋的“cwxp”區(qū)域；并且，模板中與所要建模的cys殘基也具有保守性，這樣我們就保留了對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)的二硫鍵；在使用2rh1進(jìn)行建模時(shí)，由于icl3遠(yuǎn)離結(jié)合口袋，而且在2rh1晶體結(jié)構(gòu)中icl3被用于提高蛋白熱穩(wěn)性的t4l取代，所以icl3部分也不參與建模。根據(jù)序列比對結(jié)果，使用的prime模塊對α1腎上腺素受體三個(gè)亞型(α1a-ar、α1b-ar、α1d-ar)進(jìn)行同源模建，分別得到三個(gè)結(jié)構(gòu)。s3：采用的macromodel模塊對同源模建得到的蛋白進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化包括：固定主鏈，在模擬的辛醇環(huán)境中優(yōu)化側(cè)鏈500步；固定側(cè)鏈，在模擬的辛醇環(huán)境中優(yōu)化主鏈500步；在模擬的辛醇環(huán)境中全局優(yōu)化500步，得到α1-ar亞型蛋白α1a-ar，α1b-ar和α1d-ar的三維晶體結(jié)構(gòu)模型。通過上述α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型的建立方法建立得到的具體模型構(gòu)象如圖1所示：α1腎上腺素受體的每個(gè)亞型均顯示有七個(gè)螺旋，三個(gè)膜內(nèi)loop和三個(gè)膜外loop，符合gpcr的結(jié)構(gòu)特征。實(shí)施例二本實(shí)施例提供一種α1-ar亞型蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)模型的評價(jià)方法：采用procheck對實(shí)施例一得到的α1a-ar，α1b-ar和α1d-ar的三維晶體結(jié)構(gòu)模型的生理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行評估分析，得到的ramachandranplot圖可用于闡述蛋白質(zhì)或肽立體結(jié)構(gòu)中肽鍵內(nèi)α碳原子和羰基碳原子間的鍵的旋轉(zhuǎn)度、對α碳原子和氮原子間的鍵的旋轉(zhuǎn)度，主要用來指明蛋白質(zhì)或肽類中氨基酸的允許和不允許的構(gòu)象。得到的ramachandranplot圖中超過90％的氨基酸位于核心區(qū)域，則符合離體化學(xué)能量規(guī)則。本發(fā)明的procheck結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示，結(jié)果分析如下：α1a-ar模型的ramachandranplot圖(拉氏圖)顯示模型中的氨基酸：90.8％的氨基酸位于核心區(qū)域，7.9％的氨基酸位于允許區(qū)域，0.4％的氨基酸位于最大允許區(qū)域，只有0.8％的氨基酸位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域。p35348模型中99.2％的蛋白質(zhì)殘基的二面角都在合理的范圍之內(nèi)，符合立體化學(xué)能量規(guī)則。α1b-ar模型的拉氏圖顯示模型中的氨基酸：91.7％的氨基酸位于核心區(qū)域，7％的氨基酸位于允許區(qū)域，0.8％的氨基酸位于最大允許區(qū)域，只有0.4％的氨基酸位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域。p35368模型中99.6％的蛋白質(zhì)殘基的二面角都在合理的范圍之內(nèi)，符合立體化學(xué)能量規(guī)則。α1d-ar模型的拉氏圖顯示模型中的氨基酸：90.9％的氨基酸位于核心區(qū)域，5.8％的氨基酸位于允許區(qū)域，1.7％的氨基酸位于最大允許區(qū)域，只有1.7％的氨基酸位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域。p25100模型中98.3％的蛋白質(zhì)殘基的二面角都在合理的范圍之內(nèi)，符合立體化學(xué)能量規(guī)則。另外，本發(fā)明還采用profile3d分析方法來分析同源模建的可信度，該方法采用3d-1d的打分函數(shù)來檢測所構(gòu)建模型與自身氨基酸序列的匹配度關(guān)系，分?jǐn)?shù)越高，說明同源模建的可信度越大，profile-3d圖能顯示序列中每個(gè)氨基酸的打分。結(jié)果顯示本發(fā)明實(shí)施例一得到的α1a-ar，α1b-ar和α1d-ar的三維晶體結(jié)構(gòu)模型的氨基酸殘基的verifyscore平均值大于0.2，模型通過了verify3d檢測，結(jié)果如圖5、圖6和圖7所示。實(shí)施例三本實(shí)施例依據(jù)實(shí)施例一得到的α1a-ar，α1b-ar和α1d-ar的三維晶體結(jié)構(gòu)模型，根據(jù)gpcr的普遍結(jié)合口袋所處的位置，模建α1-ar三個(gè)亞型α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar可能的結(jié)合口袋，并找到α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar三個(gè)亞型關(guān)鍵殘基，具體結(jié)果如圖8、圖9和圖10所示。α1a–ar、α1b-ar和α1d-ar三個(gè)亞型的關(guān)鍵殘基包括：在193位的氨基酸殘基分別為ile193、val193和ile193，在293位的氨基酸殘基分別為met293、leu293和leu293，在302位的氨基酸分別為lys302、leu302和leu302。盡管α1-ar三個(gè)亞型周圍的氨基酸殘基非常類似，但每個(gè)亞型仍有其所特有的氨基酸殘基，這為解釋α1-ar亞型拮抗劑的選擇度提供了理論依據(jù)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有如下的有益效果：(1)α1-ar是g蛋白偶聯(lián)受體家族的重要成員，盡管目前已從序列上對其亞型進(jìn)行了準(zhǔn)確的區(qū)分，然而α1-ar的三維蛋白晶體結(jié)構(gòu)仍尚未得到，本發(fā)明提供了α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar的模型構(gòu)象，為準(zhǔn)確的研究靶點(diǎn)和拮抗劑的構(gòu)效關(guān)系提供了基礎(chǔ)；(2)本發(fā)明提供的α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar的模型構(gòu)象的建立方法，為建立α1-ar模型構(gòu)象提供了可靠的構(gòu)建方法；(3)本發(fā)明根據(jù)gpcr的普遍結(jié)合口袋所處的位置，模建了α1-ar三個(gè)亞型蛋白α1a-ar、α1b-ar和α1d-ar可能的結(jié)合口袋，并找到關(guān)鍵殘基，為解釋α1-ar亞型選擇性拮抗劑的選擇度提供了理論依據(jù)。需要注意的是，除非另有說明，本申請使用的技術(shù)術(shù)語或者科學(xué)術(shù)語應(yīng)當(dāng)為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的通常意義。除非另外具體說明，否則在這些實(shí)施例中闡述的部件和步驟的相對步驟、數(shù)字表達(dá)式和數(shù)值并不限制本發(fā)明的范圍。在這里示出和描述的所有示例中，除非另有規(guī)定，任何具體值應(yīng)被解釋為僅僅是示例性的，而不是作為限制，因此，示例性實(shí)施例的其他示例可以具有不同的值。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁12