邀請(qǐng)24名人員對(duì)本發(fā)明實(shí)施例2制備的果漿益生菌片與市售兩種同類相同生產(chǎn) 日期的果漿益生菌片進(jìn)行品評(píng)，感官打分，其中專業(yè)和非專業(yè)人員各12名，專業(yè)人員青年、 中年、老年各4名，男女各半，非專業(yè)人員少年、青年、中年、老年各3名，男女各半；打分包括 外觀（20分）、質(zhì)地（25分）、風(fēng)味（30分）、口感（25分）四個(gè)方面，打分人員獨(dú)立進(jìn)行，互 不影響，以保證品評(píng)結(jié)果準(zhǔn)確。對(duì)品評(píng)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，均分值取近似值，保留整數(shù)，具體見(jiàn) 表2 :
[0151] 表2感官品評(píng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
[0154] 注：同一行內(nèi)標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P < 0.05)，標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差 異極顯著（P < 0. 01)，標(biāo)有相同字母表示差異不顯著（P > 0. 05)。
[0155] 以上結(jié)果表明，本發(fā)明制備的果漿益生菌片從外觀、質(zhì)地、風(fēng)味和口感任何一方面 都要明顯優(yōu)于市售果漿益生菌片，特別是外觀、風(fēng)味和口感極好，同時(shí)也適合不同年齡段、 不同消費(fèi)層次的消費(fèi)者食用。
[0156] 需要說(shuō)明的是：本發(fā)明實(shí)施例3-6制備的果漿益生菌片同樣具有上述實(shí)驗(yàn)效果， 各實(shí)施例之間及與上述實(shí)驗(yàn)效果差異性不大。
[0157] 實(shí)施例9果汁感官、衛(wèi)生、理化質(zhì)量指標(biāo)及酶活性對(duì)比試驗(yàn)
[0158] 以西瓜為原料，以本發(fā)明實(shí)施例2步驟2)方法制得的西瓜原汁為試驗(yàn)組，以采用 現(xiàn)有的熱力護(hù)色、鈍酶工藝制備的西瓜汁為對(duì)照組，分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的西瓜汁進(jìn)行 感官、理化及衛(wèi)生指標(biāo)（按果蔬汁飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB19297-2003中低溫復(fù)原果漿檢測(cè)菌落總 數(shù)、大腸桿菌、致病菌、霉菌、酵母、殘留農(nóng)藥、重金屬等衛(wèi)生指標(biāo)，）、多酚氧化酶酶活性下降 率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3 :
[0159] 表 3
[0160] CN 105123924 A 說(shuō)明干ι 16/22 頁(yè)
[0162] 以上結(jié)果表明：本發(fā)明制備的西瓜原汁（試驗(yàn)組）與現(xiàn)有技術(shù)（對(duì)照組）相比可最 大限度地保留西瓜天然色澤和風(fēng)味，與西瓜的天然色澤、口感和風(fēng)味基本接近，不添加任何 香精和色素，可溶性固形物含量較高，具有較高的榨汁率；本發(fā)明制備的西瓜原汁污染雜菌 種類少，含量低，過(guò)程污染風(fēng)險(xiǎn)小，對(duì)照組菌落總數(shù)和大腸菌群雖然合格，但微生物種類多、 含量較高，如不熱力殺菌，存在后期益生菌發(fā)酵失敗的風(fēng)險(xiǎn)；本發(fā)明果汁制備過(guò)程對(duì)原料采 用了超聲清洗，有效降低了農(nóng)殘、毒素及重金屬離子的含量，現(xiàn)有技術(shù)制備的西瓜原汁雖然 合格，但存在較大的食品安全隱患，長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人體造成積累性嚴(yán)重危害；本發(fā)明制備的 西瓜原汁多酚氧化酶活性低，有效防止了后序加工過(guò)程的酶促褐變。
[0163] 經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明實(shí)施例3-6制備的果汁與實(shí)施例2感官、理化及衛(wèi)生指標(biāo)、酶活性 下降率檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，同樣具有優(yōu)良的食品安全性、非生物穩(wěn)定性和微生物穩(wěn)定 性。
[0164] 實(shí)施例10本發(fā)明果漿益生菌片益生性試驗(yàn)
[0165] 將本發(fā)明實(shí)施例2制備的果漿益生菌片，用無(wú)菌水制備成活菌數(shù)為2 X IoiidCFUAiL 的益生菌溶液，于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0166] 1、取保存好的IOmL益生菌溶液注入到試管1中，采用十倍逐級(jí)稀釋至10 8,取ImL 稀釋液在平板上，將滅菌后冷卻至45°C的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注在平板（滅菌）上，迅速搖 勻。再將裝有IOmL益生菌溶液的試管2置于80-90°C水浴鍋中加熱15-25min，取加熱后的 益生菌溶液進(jìn)行十倍逐級(jí)稀釋至10 8,取ImL稀釋液在平板上，將滅菌后冷卻至45°C的MRS 瓊脂培養(yǎng)基傾注在平板（滅菌）上并迅速搖勻。最后將加熱前和加熱后的平板均在35°C條 件下培養(yǎng)24h，計(jì)算加熱前后的數(shù)量。
[0167] 結(jié)果表明，活菌存活率達(dá)到了 88%以上。
[0168] 2、模擬胃液及腸液的耐受試驗(yàn)：取100g/L的鹽酸16. 4mL加蒸餾水稀釋，使pH值 分別為I. 5、2. 5和3. 5,取IOOmL稀鹽酸溶液，分別加入Ig胃蛋白酶，使其充分溶解，得模擬 胃液，微孔濾膜除菌（0. 22 μ m)備用。取磷酸二氫鉀6. 8g，加水500mL使溶解，用0.1 moL/ L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 8 ;另取胰蛋白酶10g，加水IOOmL使溶解，將兩液混合后， 加水稀釋至1000ml，得模擬腸液，微孔濾膜除菌（0.22μπι)備用。取ImL保存好的益生菌 溶液加入到9mL的模擬胃液中（即十倍逐級(jí)稀釋），并迅速在振蕩器上充分混勻，然后置于 30-45°C靜置培養(yǎng)2-4h。分別在lh、2h、3h、4h的時(shí)候取出培養(yǎng)液并立即計(jì)數(shù)殘存活菌數(shù)，與 原活菌數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，活菌存活率為98%。然后取在人工胃液中消化不同時(shí)間的培 養(yǎng)液各lmL，分別接種于9mL pH值為6. 8的人工腸液中，置于3〇-45°C靜置培養(yǎng)2-4h，并分 別在0、3、6、24h取樣，測(cè)定其活菌數(shù)，與原活菌數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明活菌存活率為99%。
[0169] 3、模擬膽鹽的耐受試驗(yàn)：用胰液素制成lg/L的溶液，并在溶液中加入0. 8%的豬 膽鹽，用10%的NaOH調(diào)整pH為8. 0,然后用0. 45 μ m微濾膜過(guò)濾并除菌。將0. 5mL保存好 的益生菌溶液接種到4. 5mL模擬膽鹽中，培養(yǎng)24h后得到培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)殘存的活菌數(shù)。將培 養(yǎng)液在滅菌生理鹽水中十倍逐級(jí)稀釋至10 8,并用MRS傾注，然后置于35°C靜置培養(yǎng)24h。 結(jié)果表明活菌存活率為99%。
[0170] 以上試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明果漿益生菌片中的益生菌益生性（耐熱性、耐pH性、耐 膽鹽）較強(qiáng)，非常適合人體胃腸環(huán)境，在模擬胃腸環(huán)境中存活率大，可有效改善胃腸功能。
[0171] 需要說(shuō)明的是：本發(fā)明實(shí)施例3-6制備的果漿益生菌片同樣具有上述實(shí)驗(yàn)效果， 各實(shí)施例之間及與上述實(shí)驗(yàn)效果差異性不大。
[0172] 實(shí)施例11本發(fā)明果漿益生菌片小鼠腸道性能試驗(yàn)
[0173] 將本發(fā)明實(shí)施例2制備的果漿益生菌片，用無(wú)菌水制備成活菌數(shù)為2 X IoiidCFUAiL 的益生菌溶液，于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0174] 選取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18_20g，常規(guī)詞養(yǎng)。從中隨機(jī)挑選40只，每 天早晨9:00灌胃鹽酸林可霉素0. 2mL (20mg) /只，其它作為對(duì)照組，每天同一時(shí)間灌胃等量 滅菌生理鹽水，連續(xù)一周，制備腸道菌群失調(diào)的小鼠模型。模型組小鼠飲食下降，未出現(xiàn)死 亡和明顯的腹瀉現(xiàn)象，排軟糞，外形正常含水分較多，墊料潮濕。將40只腸道菌群失調(diào)小 鼠，隨機(jī)分為2組，一組20只作為治療組，每天灌胃保存好的益生菌溶液0. 5ml (2 X IO1Yfu/ ml) /只，另20只作為自然恢復(fù)組，每天同一時(shí)間灌胃等量滅菌生理鹽水，連續(xù)兩周。整個(gè)試 驗(yàn)期21天，每天觀察小白鼠的生長(zhǎng)和排便情況，于第8、21天對(duì)果漿益生菌片治療組和自然 恢復(fù)組的小鼠進(jìn)行稱重，計(jì)算各組體重平均增長(zhǎng)率，結(jié)果如表4 ;每5天測(cè)各組小鼠糞便大 腸桿菌數(shù)量，計(jì)算平均數(shù)，結(jié)果如表5。取小鼠糞便約0. lg，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入3粒玻璃 珠（以0.1 g糞樣加0. 5mL稀釋液），稀釋并接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，計(jì)算每克濕便中的大腸 桿菌數(shù)。
[0175] 表4小鼠增重情況
[0179] 果漿益生菌片治療組小鼠體重平均增長(zhǎng)率（67.96% )顯著高于自然恢復(fù)組 (32. 14% );飼喂溶液后腸道大腸桿菌數(shù)量顯著下降，降低97. 07%，顯著低于自然恢復(fù)組 (24.78% )，表明本發(fā)明果漿益生菌片中的益生菌在小白鼠腸道內(nèi)迅速定植，形成優(yōu)勢(shì)菌 群，并有效抑制大腸桿菌等病原菌的生長(zhǎng)繁殖，并且定植時(shí)間長(zhǎng)，持續(xù)、有效改善了腸道性 能。
[0180] 需要說(shuō)明的是：本發(fā)明實(shí)施例3-6制備的果漿益生菌片同樣具有上述實(shí)驗(yàn)效果， 各實(shí)施例之間及與上述實(shí)驗(yàn)效果差異性不大。
[0181] 實(shí)施例12本發(fā)明果漿益生菌片對(duì)機(jī)體免疫力的影響
[0182] 1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0183] 通過(guò)運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試（小鼠游泳試驗(yàn)），驗(yàn)證本發(fā)明果漿益生菌片的提高免疫力、抗 疲勞作用。
[0184] 2實(shí)驗(yàn)材料與試劑
[0185] 2.1供試藥物：
[0186] 市售果漿益生菌片（Gl);市售果漿益生菌片（G2);本發(fā)明實(shí)施例2-6制備的果漿 益生菌片（G3-G7)。
[0187] 2. 2 試劑：
[0188] 肝/肌糖原測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物制品研究所；濃硫酸（AR)，南京化學(xué)試劑有 限公司；生理鹽水，山東長(zhǎng)富潔晶藥業(yè)有限公司。
[0189] 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0190] ICR小鼠，?，清潔級(jí)，體重18-22g，由北京醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)期間 小鼠自由飲食。
[0191] 4.主要儀器
[0192] 錯(cuò)制游泳箱（50cmX50cmX40cm)，鉛絲，低溫高速離心機(jī)：5804R型，Eppendrof公 司；水浴鍋：DK-S26型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子稱：BS224S型，Sartorius公司； 秒表，溫度計(jì)
[0193] 5.實(shí)驗(yàn)分組
[0194] 5. 1劑量分組及受試樣品給予時(shí)間：隨機(jī)將小鼠分為8組，每組10只，第1組至第 7組分別給Gl~G7的藥物，第8組為空白對(duì)照組，給予等體積的雙蒸水，每組每日均灌胃1 次，灌胃體積為〇. 2ml/10g，連續(xù)給予受試樣品30天。
[0195] 5. 2樣品配制：第1組至第7組：稱取2. 25g藥物樣品，用蒸餾水配至150ml ;空白 對(duì)照組（第8組）：雙蒸水150ml。
[0196] 6.實(shí)驗(yàn)方法
[0197] 6. 1負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥30min后，置小鼠于游泳箱中，水深不少于30cm，水溫 25±1°C，鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，記錄小鼠游泳開(kāi)始至死亡的時(shí)間，作為小鼠游泳時(shí) 間。
[0198] 6. 2小鼠血清尿素測(cè)定末次給藥30min后，在溫度為30 °C的水中不負(fù)重游泳 90min，休息60min后摘眼球采血0. 5mL (不加抗凝劑），置4°C冰箱3h，血凝固后2000r/ min離心15min,取血清送北京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)。
[0199] 6. 3肝糖原的測(cè)定末次給藥30min后，在溫度為25± 1°C的水中不負(fù)重游泳90min， 頸椎脫臼處死小鼠，用生理鹽水洗凈，并用濾紙吸干水分后，準(zhǔn)確稱取肝臟l〇〇mg，肝糖原檢 測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠肝糖原含量。
[0200] 6. 4血乳酸的測(cè)定末次給藥30min后采血，然后不負(fù)重在溫度為30°C的水中游泳 IOmin后停止。乳酸儀測(cè)定方法：分別在游泳前、游泳后、游泳后休息20min后各采血20 μ L 加入40yL破膜液中，立即充分振蕩破碎細(xì)胞用乳酸儀測(cè)定。（血乳酸曲線下面積=5Χ (游 泳前血乳酸值+3 X游泳后Omin的血乳酸值+2 X游泳后20min的血乳酸值）
[0201] 7.觀察指標(biāo)負(fù)重游泳時(shí)間，血乳酸、尿素、肝糖原值
[0202] 8.統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較
[0203] 9.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0204] 9. 1本發(fā)明果漿益生菌片對(duì)小鼠體重的影響
[0205] 各組小鼠在給予Gl~G7藥物后，前、中，后期體重分別見(jiàn)下表所示，各組小鼠的 初始體重和增重體重與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0. 05)，表明Gl~G7藥物均無(wú)明 顯的毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表6。
[0206] 表6負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)小鼠的初始體重、中期體重和結(jié)束體重
[0207] CN 105123924 A 說(shuō)明書(shū) 20/22 頁(yè)
[0212] "*"ρ〈0· 05vs 空白對(duì)照；
[0213] "**"ρ〈0· Olvs 空白對(duì)照；
[0214] 9. 3本發(fā)明果漿益生菌片對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)前后血乳酸的影響
[0215] 經(jīng)口給予小鼠本發(fā)明的果漿益生菌片后，本發(fā)明果漿益生菌片G3~G7藥物對(duì)小 鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸曲線下面積與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ρ < 0. 05)，Gl~G2藥物組小鼠 血乳酸曲線下面積與對(duì)照組比較雖有所降低，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ρ> 0.05)。結(jié)果見(jiàn)表8。
[0216] 表8本發(fā)明果漿益生菌片對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)前后血乳酸水平的影響)
[0217] CN 105123924 A 說(shuō)明書(shū) 21/22 頁(yè)
[0218] "*"ρ〈0· 05vs 空白對(duì)照；
[0219] 9. 4本發(fā)明果漿益生菌片對(duì)小鼠肝糖原的影響
[0220] 經(jīng)口給予小鼠 Gl~G7藥物后，Gl~G2藥物與空白對(duì)照組比較，小鼠肝糖原含量 均有明顯的升高，具有顯著性差異（P < 〇. 05)，本發(fā)明果漿益生菌片G3~G7藥物與與空白 對(duì)照組比較，小鼠肝糖原含量均有明顯的升高，具有極顯著性差異（P&