一種檢測腫瘤標(biāo)記物ca72-4的免疫磁珠試紙條及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是世界上最常見和高致死率的惡性腫瘤之一，也是我國最常見的惡性腫瘤之一，占消化道惡性腫瘤死亡原因的第一位，有些地區(qū)占全部惡性腫瘤死亡原因的首位，且胃癌發(fā)病率一直居高不下。有資料顯示，我國每年新發(fā)胃癌患者40萬人，死亡人數(shù)30萬人，且青年人患胃癌的比例在增加，15%左右患者為40歲以下年輕人。在中國，胃癌早期診斷率不足10%，患者診斷成胃癌時(shí)已達(dá)到晚期胃癌階段，其5年生存率不足30%;而經(jīng)過早期診斷、早期治療、及時(shí)進(jìn)行相關(guān)的醫(yī)療干預(yù)措施，可使其5年生存率達(dá)到80% -90%。因此，開發(fā)早期胃癌檢測方法可提高患者的預(yù)后。目前絕大多數(shù)醫(yī)院主要依賴X線、B型超聲、內(nèi)窺鏡檢查以及活組織病理學(xué)檢查等方法對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷。以上這些檢查有些對(duì)患者創(chuàng)傷較大，有些價(jià)格較為昂貴，需要精密的儀器設(shè)備及熟練操作的技術(shù)人員，所以難以用于大規(guī)模腫瘤檢查或健康體檢，進(jìn)而無法提高早期胃癌的診斷率。同時(shí)，輔助的檢查手段還包括腫瘤的免疫學(xué)反應(yīng)、體內(nèi)特殊化學(xué)成分的測定及酶反應(yīng)等。
[0003]人體細(xì)胞從正常向惡性轉(zhuǎn)化過程中，新陳代謝結(jié)果使細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂發(fā)生某些變化，表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞表面糖類抗原的升高。這些抗原可能發(fā)生脫落，通過檢測這些脫落的抗原可對(duì)腫瘤進(jìn)行輔助診斷、監(jiān)測療效及復(fù)發(fā)。不同于組織病理標(biāo)本，血清腫瘤標(biāo)記物檢測只需外周血采樣，簡單易行，便于反復(fù)檢查，較適合于臨床上常規(guī)的檢查、高危人群的普查和長期隨訪。
[0004]CA72-4是一種高分子量糖蛋白，在各種消化道腫瘤和卵巢癌中出現(xiàn)異常升高。對(duì)胃癌有較高的敏感性，血清CA72-4在胃癌中的陽性率文獻(xiàn)報(bào)道為36 %?94%，其特異性也較高，部分甚至達(dá)到100%。相關(guān)研宄指出血清CA72-4陽性率在早期胃癌與消化道良性疾病組間存在顯著差異，亦有報(bào)道指出進(jìn)展期胃癌中其陽性率均隨胃癌期別的增高而上升，提示CA72-4水平與腫瘤大小、浸潤深度、分期及淋巴結(jié)受累等腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)。不同類型的胃癌CA72-4陽性率亦不同，從腫瘤分化程度來看，分化差的腫瘤其CA72-4含量明顯高于分化好的腫瘤，其中以未、低分化胃癌患者最高，為72%，中、高分化癌63%，其他如印戒細(xì)胞癌、殘胃癌等約為14.3%，提示CA72-4與腫瘤病理分型關(guān)系密切。CA72-4還與胃癌患者漿膜受累、肝轉(zhuǎn)移、腹膜受累和術(shù)后生存期縮短相關(guān)。胃癌切除術(shù)后血清CA72-4較術(shù)前降低，手術(shù)前后比較有顯著性差異，因而CA72-4也可用于檢測術(shù)后是否有殘留腫瘤細(xì)胞。
[0005]目前，對(duì)于患者血液中腫瘤標(biāo)記物的檢測主要依賴免疫學(xué)檢測技術(shù)。免疫學(xué)方法是基于抗原抗體特異性反應(yīng)而建立的一種檢測方法，具有快速，敏感，特異，簡便，結(jié)果易于判斷等特點(diǎn)。主要的免疫學(xué)檢測方法有電化學(xué)發(fā)光法、ELISA、酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)等，通?？稍?4小時(shí)內(nèi)得到檢測結(jié)果。其中臨床應(yīng)用最為廣泛的是電化學(xué)發(fā)光法，具有操作簡便、通量高等特點(diǎn)，但其操作過程需要專用的實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)人員進(jìn)行檢測，操作步驟復(fù)雜，且檢測時(shí)間較長，一般需要18?24小時(shí)。
[0006]免疫層析檢測技術(shù)是ELISA技術(shù)原理的擴(kuò)展應(yīng)用。由于其簡便、有效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，在目前的定點(diǎn)即時(shí)檢測中的市場需求十分旺盛，基于此檢測模式的各種標(biāo)記分析方式還在不斷被開發(fā)并應(yīng)用到如蛋白檢測、核酸檢測、病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)等領(lǐng)域中。免疫層析技術(shù)是將免疫標(biāo)記技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合起來的一種新型檢測技術(shù)，可以利用標(biāo)記物的顯色特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物的定性、半定量、定量分析。它是以微孔濾膜為固相載體，以待測液為流動(dòng)相，利用微孔濾膜的毛細(xì)作用及虹吸作用引導(dǎo)待測液體向前流動(dòng)，同時(shí)待測液中的相關(guān)成分和固定在濾膜上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物后，滯留在檢測線上，通過對(duì)標(biāo)記物顏色的深淺或熒光的光密度分析，從而得到直觀的檢測結(jié)果。在目前市場上流通的商業(yè)化免疫層析產(chǎn)品中，大都以膠體金顆粒作為標(biāo)記物，因此又被稱為膠體金免疫層析法?；谀z體金的免疫層析方法是市場上較為成熟的免疫層析產(chǎn)品，它是根據(jù)檢測區(qū)域里檢測線的顯色情況來定性地判定檢測樣品中待分析物的有無；近來又開發(fā)了基于膠體金免疫層析方法的光學(xué)定量檢測儀，它是根據(jù)檢測線上顯色的深淺對(duì)待分析物進(jìn)行定量分析，但是這種檢測儀只能捕獲到膜表面1um左右厚度的光學(xué)信號(hào)，而對(duì)于膜深部的大部分信號(hào)檢測不到，丟失了大部分的陽性信號(hào)，導(dǎo)致這種方法的靈敏度和準(zhǔn)確性大大下降。
[0007]磁性免疫層析技術(shù)是以超順磁性顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標(biāo)記物來進(jìn)行免疫層析，通過檢測結(jié)合在超順磁性納米顆粒上的目標(biāo)物來提供對(duì)生物樣本的定量檢測數(shù)據(jù)，再利用被磁顆粒標(biāo)記抗體所捕獲的免疫復(fù)合物與磁信號(hào)之間的線性關(guān)系即可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本的快速定量檢測目的，此方法借助于磁強(qiáng)度檢測儀來捕捉檢測線上的磁信號(hào)強(qiáng)度，磁信號(hào)的捕捉不受膜厚度的影響，所有的陽性信號(hào)都能被檢測，因而能大大提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。磁性免疫層析檢測技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、線性范圍寬、操作簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。
[0008]1、目前臨床上檢測CA72-4的方法主要是傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測方法，比如電化學(xué)發(fā)光法、ELISA、酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)，其操作過程需要專用的實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)人員進(jìn)行檢測，操作步驟復(fù)雜，且檢測時(shí)間較長，一般需要18?24小時(shí)，不適合對(duì)于癌癥疾病人群的早期篩查。
[0009]2、在現(xiàn)有的快速檢測方法中，尚無報(bào)道用免疫層析檢測方法來檢測機(jī)體血清中的腫瘤標(biāo)記物CA72-4。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是利用免疫磁珠試紙條來準(zhǔn)確地、快遞地對(duì)腫瘤標(biāo)記物CA72-4進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題有:一是實(shí)現(xiàn)將羧基納米磁珠與抗CA72-4單克隆抗體偶聯(lián)在一起作為納米磁珠探針；二是確保試紙條上結(jié)合墊和樣品墊的處理液成分能保證納米磁珠探針在層析過程中能有效的發(fā)揮捕獲抗原的作用，避免層析過程中的非特異性吸附現(xiàn)象，并在檢測線上顯示所有的陽性信號(hào)。
[0011]本發(fā)明提供一種檢測腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背襯板，其特征在于，所述免疫磁珠試紙紙條所用的免疫層析法的類型為雙抗夾心法，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次相互重疊地鋪設(shè)在所述背襯板上，沿所述背襯板的長度方向各重疊部分的長度為0.5?2mm ;所述結(jié)合墊上設(shè)置有納米磁珠探針，所述納米磁珠探針包括羧基納米磁珠和抗CA72-4單克隆抗體CC49 ;所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線上設(shè)置有抗CA72-4單克隆抗體B72.3，所述質(zhì)控線上設(shè)置有羊抗鼠二抗。
[0012]優(yōu)選地，所述樣品墊和所述結(jié)合墊均是玻璃纖維素膜，所述硝酸纖維素膜是pallvividl70o不同的硝酸纖維素膜，檢測結(jié)果存在差異，商品化的pall vividl70具有較好的檢測效果。
[0013]所述的檢測腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0014]步驟一，在酸性條件下，用EDC活化羧基納米磁珠表面的羧基，并用NHS穩(wěn)定活化的羧基，再在堿性條件下加入抗CA72-4單克隆抗體CC49，使得抗體Fab端的氨基與所述羧基納米磁珠的活化的羧基相互連接形成酰胺鍵，進(jìn)而將所述羧基納米磁珠與所述抗CA72-4單克隆抗體CC49連在一起，得到所述納米磁珠探針；
[0015]步驟二，將玻璃纖維素膜浸泡在含有蔗糖、海藻糖、TritonX-1OO的BS緩沖液中，潤濕后，干燥獲得所述結(jié)合墊，將步驟一得到的所述納米磁珠探針固定到所述結(jié)合墊；
[0016]步驟三，將所述抗CA72-4單克隆抗體B72.3固定到所述檢測線，將所述羊抗鼠二抗固定到所述質(zhì)控線；
[0017]步驟四，將玻璃纖維素膜浸泡在含有NaCl、BSA、TritonX-100、PVP的BS緩沖液中，潤濕后，干燥獲得所述樣品墊；
[0018]步驟五，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次相互重疊地鋪設(shè)在所述背襯板上，沿所述背襯板的長度方向各重疊部分的長度為0.5?2mm，然后用自動(dòng)切膜機(jī)切割以設(shè)定試紙條寬度，得到所述檢測腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條。
[0019]優(yōu)選地是，所述步驟一包括活化過程、偶聯(lián)過程、封閉過程和保存過程，所述活化過程、所述偶聯(lián)過程和所述封閉過程所使用的緩沖液中均不含表面活性劑，所述保存過程使用的緩沖液中含有表面活性劑。原因在于，為提高羧基磁珠與抗體之間酰胺鍵的偶聯(lián)成功率，在封閉過程結(jié)束前的各步驟反應(yīng)緩沖液中，均不含表面活性劑，封閉結(jié)束后的洗滌過程中，緩沖液中加入定量表面活性劑，提高洗滌效果，去除反應(yīng)體系中多余的抗體及BSA，避免層析過程中的非特異性吸附現(xiàn)象。
[0020]其中，所述的表面活性劑為吐溫20、吐溫60或吐溫80。
[0021]其中，I)所述活化過程是以pH 5.50.0lM的MES溶液作為活化緩沖液，取4mg/ml粒徑約1nm的羧基納米磁珠500ul于2ml離心管中，超聲25?35min，18°C、13000rpm離心5min，棄上清后，取500ul所述活化緩沖液重懸附壁的磁珠，在漩渦振蕩器上混合均勻，18°C、13000rpm離心5min，用所述活化緩沖液重復(fù)洗滌兩次后，把磁珠重懸于500ul的所述活化緩沖液中，向磁珠溶液中加入4mgEDC固體粉末，振蕩溶解后再加入4mg的NHS固體粉末，混合均勻，置于旋轉(zhuǎn)混合器上，室溫活化15