?25min，得到產(chǎn)物一；
[0022]2)所述偶聯(lián)過程是以pH8.80.005M的BS溶液作為偶聯(lián)緩沖液，將所述活化過程中得到的所述產(chǎn)物一 18°C、12000rpm離心3min，去上清液，然后用所述偶聯(lián)緩沖液500ul洗滌磁珠，18°C、12000rpm離心5min，去上清液，接著將磁珠重懸于470ul的所述偶聯(lián)緩沖液中，再加入30ul 5mg/ml的抗CA72-4單克隆抗體CC49，混勻后置于37°C搖床中反應(yīng)3小時(shí)，然后置于室溫、旋轉(zhuǎn)混合器上過夜，得到產(chǎn)物二 ；
[0023]3)所述封閉過程是將所述偶聯(lián)過程得到的所述產(chǎn)物二 18°C、12000rpm離心5min，用所述偶聯(lián)緩沖液500ul重懸附壁磁珠，并稱取0.025gBSA粉末溶于磁珠溶液中，溶解混勻后，置于旋轉(zhuǎn)混合器上室溫下封閉反應(yīng)I小時(shí)，得到產(chǎn)物三；
[0024]4)所述保存過程是將所述封閉過程得到的所述產(chǎn)物三18°C、12000rpm離心3min，用含有0.05%吐溫20的pH8.80.005M的BST溶液洗滌磁珠，去上清液，得到所述納米磁珠探針，將得到的所述納米磁珠探針置于400ul含有0.05%吐溫20的pH8.80.005M的BST溶液中，4°C保存。
[0025]優(yōu)選地是，所述步驟二是將玻璃纖維素膜浸泡在含有5%蔗糖、2%海藻糖、0.05%TritonX-1OO的0.02M BS緩沖液中30分鐘，潤濕后，28°C干燥I小時(shí)得到結(jié)合墊；.所述步驟一所得的所述納米磁珠探針按照30cm/600ul的用量均勻噴涂在所述結(jié)合墊上，靜置20min后，置于28°C恒溫干燥箱干燥I小時(shí)，封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026]優(yōu)選地是，所述步驟三是用0.0lM pH7.4的PBS緩沖液將所述羊抗鼠二抗稀釋到lmg/ml，再添加2%的蔗糖作為質(zhì)控線噴膜液；用0.0lM pH7.4的PBS緩沖液將所述抗CA72-4單克隆抗體B72.3稀釋到2mg/ml，再添加2 %的蔗糖作為檢測(cè)線噴膜液；用噴膜機(jī)在所述硝酸纖維素膜上噴膜質(zhì)控線與檢測(cè)線，噴膜環(huán)境的溫度控制在25°C，濕度40% _60%，噴膜速度0.5?2ul/cm，所述質(zhì)控線與所述檢測(cè)線之間間隔2?10mm，所述質(zhì)控線的線條寬度與所述檢測(cè)線的線條寬度為0.5?1.5mm，噴膜完成后，將得到的硝酸纖維素膜放在28°C恒溫干燥箱干燥3小時(shí)，封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027]優(yōu)選地是，其特征在于，所述步驟三是用0.0lM pH7.4的PBS緩沖液將所述羊抗鼠二抗稀釋到lmg/ml，再添加2%的蔗糖作為質(zhì)控線噴膜液；用0.01MpH7.4的PBS緩沖液將所述抗CA72-4單克隆抗體B72.3稀釋到2mg/ml，再添加2 %的蔗糖作為檢測(cè)線噴膜液；用噴膜機(jī)在所述硝酸纖維素膜上噴膜質(zhì)控線與檢測(cè)線，噴膜環(huán)境的溫度控制在25°C，濕度40% _60%，噴膜速度0.5?2ul/cm，所述質(zhì)控線與所述檢測(cè)線之間間隔2?10mm，所述質(zhì)控線的線條寬度與所述檢測(cè)線的線條寬度為0.5?1.5mm，噴膜完成后，將得到的硝酸纖維素膜放在28°C恒溫干燥箱干燥3小時(shí)，封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0028]所述的檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條的應(yīng)用方法，其特征在于:
[0029]步驟一，將待測(cè)樣本加到所述樣品墊上，通過層析作用所述待測(cè)樣本會(huì)依次經(jīng)過結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；
[0030]步驟二，待層析結(jié)束結(jié)果穩(wěn)定后，用磁強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)分析所述檢測(cè)線的磁信號(hào)強(qiáng)度和所述控制線的磁信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的定量檢測(cè)。
[0031]本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為:
[0032]1、本發(fā)明首次采用免疫層析方法檢測(cè)檢測(cè)人機(jī)體血清/血漿中的腫瘤標(biāo)記物CA72-4。操作時(shí)，只需將適量的待測(cè)血清/血漿滴加在試紙條的樣品墊端，待層析結(jié)束后，20分鐘內(nèi)就可出結(jié)果。該檢測(cè)方法比ELISA方法或其他檢測(cè)CA72-4的試劑盒檢測(cè)快速、操作簡便、無需專業(yè)人員操作及專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，更容易在廣大人民群眾中普及，方便人們對(duì)于早期胃癌的自檢，及胃癌根治患者的隨訪及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。
[0033]2、本發(fā)明所涉及的試紙條，是利用納米磁珠探針作為標(biāo)記物，通過抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)富集在檢測(cè)線上，再利用磁強(qiáng)度檢測(cè)儀探測(cè)檢測(cè)線上的磁信號(hào)強(qiáng)度，得到定量檢測(cè)結(jié)果。與膠體金試紙條相比，此方法不受膜厚度的影響，所有的陽性信號(hào)都能被檢測(cè)，結(jié)果數(shù)字化定量，可信程度高，因而能大大提高檢測(cè)CA72-4的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0034]3、本發(fā)明所檢測(cè)的是糖蛋白CA72-4，檢測(cè)樣本是人體血清或血漿，相對(duì)于組織病理學(xué)檢查，該檢測(cè)樣本較易獲得；且該糖蛋白已被證實(shí)其對(duì)于胃癌的早期篩查、腫瘤的分化、分期、轉(zhuǎn)移均有較高的靈敏度及特異度。
[0035]4.本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果具有非常好的線性范圍，檢測(cè)CA72-4的線性范圍是>4U/ml，檢測(cè)下限可以達(dá)到3U/ml。
【附圖說明】
[0036]圖1是本發(fā)明所述的檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0037]其中:1-樣品墊、2-結(jié)合墊、3-納米磁珠探針、4-檢測(cè)線、5-質(zhì)控線、6_硝酸纖維素膜、7-吸水墊、8-背襯板。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0039]本發(fā)明提供一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條，如圖1所示，包括樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜6、吸水墊7和背襯板8，所用的免疫層析法的類型為雙抗夾心法，所述樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜6、吸水墊7依次相互重疊0.5?2mm粘貼在所述背襯板8上；所述結(jié)合墊2上設(shè)置有納米磁珠探針3，所述納米磁珠探針3包括羧基納米磁珠和抗CA72-4單克隆抗體CC49 ;所述硝酸纖維素膜6上設(shè)置有檢測(cè)線4和質(zhì)控線5，所述檢測(cè)線4上設(shè)置有抗CA72-4單克隆抗體B72.3，所述質(zhì)控線5上設(shè)置有羊抗鼠二抗。所述樣品墊I是玻璃纖維素膜，所述結(jié)合墊2是玻璃纖維素膜，所述硝酸纖維素膜6是商品化的 pall vividl70o
[0040]實(shí)施例一:一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物CA72-4的免疫磁珠試紙條的制備及應(yīng)用
[0041]步驟一:納米磁珠探針的制備
[0042]I)活化:以pH 5.50.0lM的2嗎啉代乙磺酸(簡稱MES)溶液作為活化緩沖液，取4mg/ml液態(tài)羧基磁珠(屬于羧基納米磁珠，磁珠粒徑大約10nm)500ul于2ml離心管中，超聲30min左右，用冷凍離心機(jī)離心(18°C、13000rpm、5min)，棄上清后，取500ul活化緩沖液重懸附壁磁珠，在漩渦振蕩器上混合均勻(如有必要可超聲數(shù)分鐘)，繼續(xù)離心，參數(shù)相同。用活化緩沖液重復(fù)洗滌兩次后，把磁珠重懸于500ul的活化緩沖液中。分別稱取4mg的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(簡稱NHS)固體粉末，先向磁珠溶液中加入4mgEDC，振蕩溶解后再加入4mg的NHS，混合均勻，置于旋轉(zhuǎn)混合器上，室溫活化20min。
[0043]2)偶聯(lián):以pH8.80.005M的硼酸鹽溶液(簡稱BS)作為偶聯(lián)緩沖液?；罨?0min后，冷凍離心機(jī)離心(18°C、12000rpm、3min),除去未反應(yīng)的活化劑。再用偶聯(lián)緩沖液500ul洗滌磁珠一次(離心參數(shù)調(diào)整為18°C、12000rpm、5min)，然后將磁珠重懸于470ul的偶聯(lián)緩沖液中，再加入30ul 5mg/ml的抗CA72-4單克隆抗體CC49。混勻后置于37°C搖床中反應(yīng)3小時(shí)。3小時(shí)后置于室溫、旋轉(zhuǎn)混合器上過夜。
[0044]3)封閉:將偶聯(lián)后的磁珠離心(18°C、12000rpm、5min)，用偶聯(lián)緩沖液500ul重懸附壁磁珠，并稱取0.025g牛血清白蛋白(簡稱BSA)粉末溶于磁珠溶液中，溶解混勻后，置于旋轉(zhuǎn)混合器上室溫下封閉反應(yīng)I小時(shí)。
[0045]4)保存:封閉反應(yīng)結(jié)束后，離心(18°C、12000rpm、3min)，用ρΗ8.80.005Μ的硼酸鹽吐溫溶液(簡稱BST，含0.05% ν/ν吐溫20)洗滌磁珠一次，并將磁珠最終置于400ul該緩沖液中。4°C保存。
[0046]步驟二:結(jié)合墊的處理及納米探針的固定
[0047]I)將玻璃纖維素膜(0.5cm*30cm)浸泡在含有5 %蔗糖、2 %海藻糖、0.05 %TritonX-1OO的0.02M BS緩沖液中30分鐘潤濕后，28°C干燥I小時(shí)即得結(jié)合墊。
[0048]2)所得納米磁珠探針按照30cm/600ul的用量均勻噴涂在結(jié)合墊上，靜置20分鐘后，置于28°C恒溫干燥箱干燥I小時(shí)，封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0049]步驟三:硝酸纖維素膜的選取及抗體的固定
[0050]I)硝酸纖維素膜選自商品化的pall vividl70,孔徑8um,規(guī)格是2cm*30cm。
[0051]2)用0.0lM pH7.4的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)將羊抗鼠二抗稀釋到lmg/ml，并添加2%的蔗糖作為質(zhì)控線噴膜液；用0.0lM pH7.4的PBS將抗CA72-4單克隆抗體B72.3稀釋到2mg/ml，添加2%的蔗糖作為檢測(cè)線噴膜液。
[0052]3)用B1 Dot噴膜機(jī)在硝酸纖維素膜上噴膜質(zhì)控線與檢測(cè)線。噴膜環(huán)境的溫度控制在25°C，濕度大約40 % -60 %，噴膜速度大約lul/cm，質(zhì)控線與檢測(cè)線之間間隔4mm，線條寬度約0.8_。噴膜完成后放在28°C恒溫干燥箱干燥3小時(shí)，封袋置于4°C保