一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測(cè)試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測(cè)試 紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] "碩鼠"的問世（Palmiteretal.，1982)，加速了轉(zhuǎn)基因生物的研究?？寺【d羊"多 莉"的誕生（Wilmutetal.，1997)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動(dòng)物方面的廣泛應(yīng)用。目前研 制成功多種用于生產(chǎn)藥用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)抗病力的轉(zhuǎn)基因豬、牛、 羊（Schniekeetal.，1997;Toledoetal.，2006)，其潛在的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益巨大，具 有良好的商品化前景。但是由于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品存在風(fēng)險(xiǎn)，轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的管理 一直受到各國(guó)政府的高度重視。
[0003] 為了保護(hù)人類自身的健康和生存環(huán)境，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家相繼制定了轉(zhuǎn)基 因生物安全法規(guī)，對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品采用標(biāo)識(shí)制度，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)出境進(jìn)行嚴(yán)格管理。 要使這些法規(guī)、制度得以順利實(shí)施，需要有效的檢測(cè)技術(shù)做支撐。目前轉(zhuǎn)基因生物及其加工 食品的檢測(cè)方法主要包括基因水平的檢測(cè)和蛋白水平的檢測(cè)，在蛋白檢測(cè)方面，目前人乳 鐵蛋白的檢測(cè)方法以ELISA檢測(cè)法為主，但ELISA方法操作時(shí)間較長(zhǎng)，而且需要酶標(biāo)儀等專 業(yè)設(shè)備，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此建立一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法很有必要。
[0004] 目前最適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法主要是免疫膠體金技術(shù)，免疫膠體金技術(shù)是以膠 體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸 (HAuC14)在還原劑如抗壞血酸、檸檬酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并 由于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與 蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)牢固結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物 特性。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合 物的免疫和生物學(xué)特性，使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng) 域。
[0005] 將雙抗夾心試紙用于人乳鐵蛋白的檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)人乳鐵蛋白的快速簡(jiǎn)便地檢 測(cè)；但是，現(xiàn)有的抗人乳鐵蛋白的抗體因敏感性和特異性較低且配對(duì)性較差，無(wú)法滿足雙抗 夾心免疫試紙檢測(cè)人乳鐵蛋白的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種敏感性和特異性較高人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測(cè) 試紙條，該試紙條能夠滿足雙抗夾心免疫試紙檢測(cè)人乳鐵蛋白的要求，實(shí)現(xiàn)對(duì)人乳鐵蛋白 的快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測(cè)試紙條， 該免疫膠體金試紙包括依次相連接的吸水墊、基膜、金標(biāo)墊和樣品墊；所述基膜上設(shè)置有C 線和T線，所述C線上包被有羊抗鼠IgG的抗體，所述金標(biāo)墊中含有膠體金標(biāo)記的第一單 克隆抗體；所述T線上包被有第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10595的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到，所述第二單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10594 的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到。
[0008] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠通過雙抗夾心免疫試紙檢測(cè)方法，對(duì)人乳鐵蛋白 的檢測(cè)取得lOng/mL的靈敏度，對(duì)牛乳鐵蛋白和羊乳鐵蛋白不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，并且對(duì)人溶 菌酶轉(zhuǎn)基因牛、人a-乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因牛不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，具有較高的敏感度和特異性。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
[0010] 生物材料保藏
[0011] 本發(fā)明的一株雜交瘤細(xì)胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編號(hào) 為CGMCC N0. 10595,保藏日期為2015年5月8日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所，分類命名為雜交瘤細(xì)胞株。
[0012] 本發(fā)明的另一株雜交瘤細(xì)胞株是本發(fā)明的發(fā)明人自行融合篩選得到的，其保藏編 號(hào)為CGMCC N0. 10594,保藏日期為2015年5月8日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所，分類命名為雜交瘤細(xì)胞株。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是免疫膠體金試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015] 圖2是試紙理論檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0016] 圖3為試紙條特異性試驗(yàn)檢測(cè)圖。
[0017] 圖4為部分陽(yáng)性樣品檢測(cè)圖。
[0018] 圖5為部分陰性樣品檢測(cè)圖。
[0019] 附圖標(biāo)記說(shuō)明
[0020]1樣品墊2膠體金墊3基膜
[0021] 4吸收墊5 T線6 C線
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描 述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0023] 本發(fā)明提供了一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測(cè)試紙條，該免疫膠體金試紙包 括依次相連接的吸水墊、基膜、金標(biāo)墊和樣品墊；所述基膜上設(shè)置有C線和T線，所述C線上 包被有羊抗鼠IgG的抗體，所述金標(biāo)墊中含有膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體；所述T線上 包被有第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC N0. 10595的雜交瘤細(xì) 胞株分泌得到，所述第二單克隆抗體由保藏編號(hào)為CGMCC N0. 10594的雜交瘤細(xì)胞株分泌得 到。
[0024] 其中，免疫膠體金試紙的檢測(cè)原理可能包括：將待檢樣品滴入樣品墊中，若樣品 中有人乳鐵蛋白，待檢樣品中人乳鐵蛋白先和膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體（3B4)結(jié)合， 由于毛細(xì)管作用，人乳鐵蛋白和膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體形成的復(fù)合體沿基膜向前泳 動(dòng)，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)遇到包被在硝酸纖維素基膜上的第二單克隆抗體（5C5)，由于第一單克隆 抗體和第二單克隆抗體分別能結(jié)合人乳鐵蛋白的不同抗原表位結(jié)合，從而形成"膠體金標(biāo) 記的第一單克隆抗體（3B4)-人乳鐵蛋白-第二單克隆抗體（5C5)"復(fù)合體，從而使得膠體 金富集在檢測(cè)線上，形成特異性的紅色層析線；沒有和人乳鐵蛋白結(jié)合的膠體金標(biāo)記的第 一單克隆抗體則會(huì)直接通過檢測(cè)線，達(dá)到質(zhì)控線后被質(zhì)控線上的羊抗鼠IgG捕獲，從而使 得膠體金富集在質(zhì)控線上形成紅色層析線，即判為陽(yáng)性結(jié)果；若樣品中無(wú)人乳鐵蛋白，由于 無(wú)法在檢測(cè)線上形成"膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體（3B4)-人乳鐵蛋白-第二單克隆抗 體（5C5) "復(fù)合體，從而使得檢測(cè)線上不會(huì)產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應(yīng)，沒有和人乳鐵蛋白結(jié) 合的膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體則會(huì)直接通過檢測(cè)線，達(dá)到質(zhì)控線后被質(zhì)控線上的羊抗 鼠IgG捕獲，從而使得膠體金富集在質(zhì)控線上形成紅色層析線，即判為陰性結(jié)果。
[0025] 本發(fā)明中，使用保藏編號(hào)為CGMCC N0. 10595的雜交瘤細(xì)胞株和保藏編號(hào)為CGMCC N0. 10594的雜交瘤細(xì)胞株分別制備和純化第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的方法可以 為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如小鼠腹水法和親和層析法。
[0026] 本發(fā)明中，將單克隆抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如 可以包括：將0. 01重量％的HAuC14溶液加熱煮沸后加入1重量％的檸檬酸三鈉溶液直至 溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時(shí)，繼續(xù)回流l〇min后停止加熱，冷卻至室溫，即得到膠體 金；取lml制取好的膠體金，用1重量％的1(20)3調(diào)節(jié)pH值到8.0,加入8yg單克隆抗體， 混合均勻，室溫反應(yīng)40min;加入5重量％的BSA至終濃度為0. 1重量％，靜置30min;先用 低速（1500r/min)離心15分鐘，棄去由凝聚的金膠粒形成的沉淀；然后用10000r/min離心 30分鐘；仔細(xì)吸出上清，沉淀物用0.lml含1%BSA的0. 1MPBS(PH7. 4)復(fù)溶，加入5%疊 氮鈉至終濃度為0. 05%，4°C保存。
[0027] 本發(fā)明中，制備免疫膠體金試紙的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如可以包括： 用噴金點(diǎn)膜機(jī)將第二單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴于硝酸纖維素膜上，形成相互平行的檢測(cè) T線和質(zhì)控C線，然后烘干；將膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體用噴金點(diǎn)膜機(jī)均勻的噴在金標(biāo) 墊上；然后將樣品墊、金標(biāo)墊、噴有T線和C線的基膜（硝酸纖維素膜）和吸水紙依次連接 組裝，而后裁切包裝備用。
[0028] 其中，所述金標(biāo)墊中所含有膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體可以是由5-100 y g/mL 膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體溶液以〇.5-5 y L/cm的噴涂速度通過噴金點(diǎn)膜機(jī)噴涂在金 標(biāo)墊上干燥后得到的。
[0029] 其中，所述T線上包被的第二單克隆抗體可以是由0. 2-5mg/mL的第二單克隆抗體 溶液以0. 2-4 y L/cm的噴涂速度噴涂在T線上干燥后得到的。
[0030] 其中，所述C線上包被的羊抗鼠IgG的抗體可以是由0. 2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的 抗體溶液以〇.2-4 y L/cm的噴涂速度通過噴金點(diǎn)膜機(jī)噴涂在C線上干燥后得到的。
[0031] 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明：
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 本實(shí)施例用于說(shuō)明人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測(cè)試紙條所用的抗體對(duì)的篩選。
[0034] 人乳鐵蛋白（hLF)的蛋白序列如NCBIGenbank序列號(hào)：U95626所示。按照 文獻(xiàn)(Penghua Yang, et al. , Cattle Mammary Bioreactor Generated by a Novel Procedure of Transgenic Cloning for Large-Scale Production of Functional Human Lactoferrin. ,PLoS 0NE,2008,3(10)，e3453)中的方法獲得人乳鐵蛋白（hLF)的轉(zhuǎn)基因乳 牛。
[0035] 向轉(zhuǎn)基因乳牛肌肉注射催乳針（購(gòu)自西安草灘制藥廠生產(chǎn)的不孕牛催乳針，該產(chǎn) 品為盒裝，I號(hào)針10支，II號(hào)針3支）進(jìn)行催乳，其中I號(hào)針連續(xù)肌肉注射10天，每日一 次。II號(hào)針在第13、15、17天各注射一支。從注射7天開始每天溫水按摩轉(zhuǎn)基因乳牛乳房， II號(hào)針注射完畢后開始人工擠乳兩周，每天兩次，得到奶樣。
[0036] 將奶樣于4°C、4500rpm離心15min后取出，可見上層為凝固的乳脂，將下層液體吸 出并轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管。將脫脂乳用1M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3. 8-4. 6,使得酪蛋白沉淀出 來(lái)，其中脫脂乳與1M的HC1的體