積比為25 :1 ;然后將調(diào)好pH值的奶樣于4°C、5000rpm離 心12min。取出，沉淀為酪蛋白，上清液為乳清蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管。用1M的 NaOH水溶液將上清液的pH值調(diào)回至7. 5，其中上清液與1M的NaOH水溶液的體積比為25:1。 將調(diào)好pH值的奶樣于4°C、5000rpm離心15min，將離心后的上清收集，得到純化的乳清。
[0037] 使用HiLoadTM16/10SPSepharoseHighperformance色譜柱，將其預(yù)先用 0? 4M 的NaCl、20mM的Na3P04 (pH7. 5)平衡5個柱體積。15ml脫脂乳通過注射器上樣，進(jìn)入上樣環(huán)。 用0. 4M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)平衡5個柱體積，未結(jié)合的蛋白收集到一離心管中， 用0. 4M-1M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)洗脫15個柱體積，收集分離到的各個峰值蛋白， 并合并同一峰值的洗脫液。再用1M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)繼續(xù)洗脫2個柱體積， 最后用1M的NaCl、20mM的Na3P04(pH7. 5)洗脫5個柱體積。上述操作均在AKTApuriferlO 液相色譜儀上進(jìn)行。最后得到在0.6M的NaCl的洗脫峰。收集該洗脫峰的洗脫液并進(jìn)行超 濾濃縮和冷凍干燥，然后經(jīng)N端測序和蛋白電泳，證明該洗脫峰為重組提純的人乳鐵蛋白 (hLF) 〇
[0038] 用提純的人乳鐵蛋白（hLF)免疫雌性BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì) 胞融合，經(jīng)ELISA法進(jìn)行陽性克隆篩選、通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗hLF 單克隆抗體的10個克隆的細(xì)胞株。將這些雜交瘤細(xì)胞株分別注射至小鼠腹腔，收集腹水， 親和柱純化得10種單克隆抗體。
[0039] 將這10種單克隆抗體兩兩組合得到45個組合，將各個組合分別制備膠體金免疫 試紙，具體地，將每一個組合中的一個抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記并制備金標(biāo)墊，另外一個抗體用 于制備T線。
[0040] 膠體金的制備方法包括：將0. 01重量％的撤11(：14溶液加熱煮沸后加入1重量％的 檸檬酸三鈉溶液直至溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時，繼續(xù)回流l〇min后停止加熱，冷 卻至室溫，即得到膠體金。將單克隆抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記的方法包括：取lml制取好的膠體 金，用1重量％的K2C03調(diào)節(jié)pH值到8. 0,加入8yg單克隆抗體，混合均勾，室溫反應(yīng)40min; 加入5重量％的BSA至終濃度為0. 1重量％，靜置30min;先用低速（1500r/min)離心15 分鐘，棄去由凝聚的金膠粒形成的沉淀；然后用l〇〇〇〇r/min離心30分鐘；仔細(xì)吸出上清， 沉淀物用0.11111含1%834的0.邡？83&117.4)復(fù)溶，加入5%疊氮鈉至終濃度為0.05%， 4°C保存。
[0041] 用噴金點(diǎn)膜機(jī)將第二單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴于硝酸纖維素膜上，形成相互平 行的檢測T線和質(zhì)控C線，然后烘干；將膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體用噴金點(diǎn)膜機(jī)均勻的 噴在金標(biāo)墊上；然后如圖1所示，將樣品墊、金標(biāo)墊、噴有T線和C線的基膜（硝酸纖維素 膜）和吸水紙依次連接組裝，而后裁切包裝備用。共得到45種免疫膠體金試紙。對于金標(biāo) 墊，噴金點(diǎn)膜機(jī)的噴涂速度為2. 0yL/cm。對于T線和C線，噴金點(diǎn)膜機(jī)的噴涂速度為1yL/ cm，T線為濃度lmg/mL的第二單克隆抗體，C線為濃度lmg/mL的羊抗鼠IgG抗體。
[0042] 將人乳鐵蛋白的PBS溶液作為陽性樣本，將牛乳鐵蛋白PBS溶液作為陰性樣本，對 上述45種免疫膠體金試紙進(jìn)行篩選。去除44種對人乳鐵蛋白呈現(xiàn)陰性反應(yīng)或?qū)εＨ殍F蛋 白呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的免疫膠體金試紙，最終得到一種免疫膠體金試紙，該免疫膠體金試紙能 夠?qū)?0ng/mL的人乳鐵蛋白PBS溶液呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，并且對100yg/mL的牛乳鐵蛋白PBS 溶液不呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。該免疫膠體金試紙即為本實(shí)施例篩選得到的免疫膠體金試紙。該免 疫膠體金試紙所用的第一單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株3B4分泌得到的，該雜交瘤細(xì)胞株 的保藏編號為CGMCCN0. 10595 ;該免疫膠體金試紙所用的第二單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞 株5C5分泌得到的，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號為CGMCCN0. 10594。經(jīng)鑒定這兩株株單克 隆抗體亞型均為IgGl+kappa。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條（即實(shí)施例1 篩選得到的免疫膠體金試紙）在檢驗(yàn)實(shí)際樣本時的敏感性和特異性。
[0045] (1)樣品制備：采集的牛奶、溶解的奶粉及液態(tài)乳制品。取約200y1的牛奶樣品 加入樣品管中。
[0046] (2)檢測：取出實(shí)施例1篩選得到的免疫膠體金試紙試紙條，室溫平衡20分鐘，打 開包裝取出試紙條，將試紙條按照箭頭方向插入樣品管中，靜置10-15分鐘，判定結(jié)果。
[0047] (3)結(jié)果判定：當(dāng)時紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫 紅色檢測線，判為陰性，記為"一"；當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，同時出現(xiàn)肉眼 可見的紫紅色檢測線，判為陽性，記為" + ";檢測線顏色深度與待檢抗原量成正比，顏色越深 說明待檢抗原含量越高，質(zhì)控線無條帶則判為試紙條失效。判定結(jié)果示意圖見附圖2。
[0048] 選用購頭的Sigma人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純化）的PBS洛液、人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（重 組表達(dá)）的PBS溶液、購買的Sigma牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的PBS溶液、購買的Sigma羊乳鐵 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的PBS溶液、以及購買的Sigma人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的PBS溶液和購買的Sigma人 a_乳清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的PBS溶液進(jìn)行特異性測定，檢測結(jié)果如表1，結(jié)果表明，該試紙條可 以特異性識別人乳鐵蛋白，但與牛乳鐵蛋白、羊乳鐵蛋白、人溶菌酶和人a-乳清白蛋白不 呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。部分檢測結(jié)果如圖3所示。
[0049] 表1試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果
[0050]
[0051] 將人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純化）和人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（重組表達(dá)）進(jìn)行梯度稀釋，用 膠體金試紙條進(jìn)行靈敏度檢測，檢測結(jié)果見表2,表2結(jié)果顯示，試紙條的靈敏度可達(dá)10ng/mL〇
[0052] 表2試紙條靈敏度試驗(yàn)結(jié)果
[0053]
[0054] 實(shí)施例3
[0055] 采集140份已知人乳鐵蛋白陰性的牛奶（其中包括100份采集自位于河北大廠的 奶牛養(yǎng)殖場的非轉(zhuǎn)基因奶牛，20份位于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的奶牛養(yǎng)殖場的轉(zhuǎn)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因 奶牛和20份位于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的奶牛養(yǎng)殖場的轉(zhuǎn)人a-乳清白蛋白的轉(zhuǎn)基因奶牛）、和22 份已知人乳鐵蛋白陽性牛奶（采集自位于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的奶牛養(yǎng)殖場，轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因 奶牛），共162份樣品，用實(shí)施例1篩選得到的免疫膠體金試紙進(jìn)行盲測，測定結(jié)果顯示140 份已知人乳鐵蛋白陰性的牛奶均顯示為檢測陰性，22份已知人乳鐵蛋白陽性牛奶均顯示為 檢測陽性，試紙條的診斷特異性為100%。部分測定結(jié)果圖見圖4和圖5所示。
[0056] 根據(jù)實(shí)施例1-3的數(shù)據(jù)可見，本發(fā)明能夠通過雙抗夾心免疫試紙檢測方法，對人 乳鐵蛋白的檢測取得lOng/mL的靈敏度，對牛乳鐵蛋白和羊乳鐵蛋白不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，并 且對人溶菌酶轉(zhuǎn)基因牛、人a_乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因牛不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，具有較高的敏感度 和特異性。這可能是由于本發(fā)明的人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條所用的單克隆抗 體對能夠高靈敏且高特異性地識別人乳鐵蛋白，并且本發(fā)明的兩個單克隆抗體能夠分別針 對不同的抗原決定簇，由此特別適合用于雙抗夾心免疫試紙的檢測。
[0057] 以上結(jié)合附圖詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí) 施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡 單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0058]另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0059] 此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條，該免疫膠體金試紙包括依次相連接的 吸水墊、基膜、金標(biāo)墊和樣品墊；其特征在于，所述基膜上設(shè)置有C線和T線，所述C線上包 被有羊抗鼠IgG的抗體，所述金標(biāo)墊中含有膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體；所述T線上包被 有第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10595的雜交瘤細(xì)胞株 分泌得到，所述第二單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO. 10594的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條，其中，所述金標(biāo)墊 中所含有膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體是由5-100 y g/mL膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體 溶液以0. 5-5 y L/cm的噴涂速度通過噴金點(diǎn)膜機(jī)噴涂在金標(biāo)墊上干燥后得到的。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條，其中，所述T線上包 被的第二單克隆抗體是由〇. 2-5mg/mL的第二單克隆抗體溶液以0. 2-4 y L/cm的噴涂速度 通過噴金點(diǎn)膜機(jī)噴涂在T線上干燥后得到的。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條，其中，所述C線上包 被的羊抗鼠IgG的抗體是由0. 2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的抗體溶液以0. 2-4 y L/cm的噴涂 速度通過噴金點(diǎn)膜機(jī)噴涂在C線上干燥后得到的。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人乳鐵蛋白雙抗夾心膠體金檢測試紙條，該免疫膠體金試紙包括依次相連接的吸水墊、基膜、金標(biāo)墊和樣品墊；所述基膜上設(shè)置有C線和T線，所述C線上包被有羊抗鼠IgG的抗體，所述金標(biāo)墊中含有膠體金標(biāo)記的第一單克隆抗體；所述T線上包被有第二單克隆抗體；所述第一單克隆抗體由保藏編號為CGMCC？NO.10595的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到，所述第二單克隆抗體由保藏編號為CGMCC？NO.10594的雜交瘤細(xì)胞株分泌。本發(fā)明能夠通過雙抗夾心免疫試紙檢測方法，對人乳鐵蛋白的檢測取得10ng/mL的靈敏度，對牛乳鐵蛋白和羊乳鐵蛋白不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，并且對人溶菌酶轉(zhuǎn)基因牛、人α-乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因牛不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)。CGMCC No.1059420150508
【IPC分類】G01N33/68
【公開號】CN105021830
【申請?zhí)枴緾N201510459441
【發(fā)明人】王勤, 林祥梅, 劉曉飛, 馮春燕, 付偉, 李曉琳, 仇松寅, 劉丹丹
【申請人】中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月30日