0PH+掌葉大黃2) (1:2)和（C0PH+掌葉大黃3) (1:3)的樣 品。
[0084]6)制備含有常春藤葉提取物、黃連提取物和越桔提取物的混合組合物。
[0085]對于越桔提取物，使用Tagen-F. (Kukje Pharm.)。以 1:1、1:2、1:3 或 3:1 的重 量比使越桔提取物與C0PH混合以制備（C0PH+越桔1) (1:1)、（C0PH+越桔2) (2:1)、（C0PH+ 越桔3) (3:1)和（C0PH+越桔4) (1:3)的樣品。
[0086] 實施例3:制備含有常春藤葉提取物、黃連提取物和甲福明的組合物。
[0087] 將50重量份的量的含有常春藤葉提取物和黃連提取物的混合組合物與350重量 份的甲福明一起進料，以制備樣品COPH+MET。
[0088] 實驗實施例1:對高級糖化終末產(chǎn)物（AGE)形成的抑制效果的實驗。
[0089] 執(zhí)行實驗以檢查實施例1和實施例2中制備的每種組合物對高級糖化終末產(chǎn)物形 成的抑制效果。
[0090] 通過混合入磷酸鹽緩沖溶液制備牛血清白蛋白（BSA) -一蛋白源。作為糖源，使用 0. 2M果糖和0. 2M葡萄糖之間的混合溶液。將實施例1和實施例2中制備的每種組合物和 氨基胍（陽性對照）分別加入BSA和糖之間的混合溶液，并培養(yǎng)7日。培養(yǎng)后，分析得到的 高級糖化終末產(chǎn)物的含量。使用微量培養(yǎng)板閱讀器（Microplate reader)(激發(fā)；350nm，發(fā) 射；450nm)基于下面方程1計算高級糖化終末產(chǎn)物的量（表1)。
[0091]【方程1】
[0092] AGE的抑制效果（％ )=
[0093] {100-(樣品的熒光強度）_ (空白樣品的熒光強度）/
[0094](對照的熒光強度）_ (空白對照的熒光強度）}xlOO
[0095]【表1】
[0096]
[0097]
[0098] 如上面表1中所示，證實了相比于為陽性對照的氨基胍，C0PH對高級糖化終末產(chǎn) 物的形成具有2倍高的抑制效果。
[0099] 另外，相比于為陽性對照的氨基胍，通過向C0PH添加葡萄籽、銀杏葉、葛根、決明 子、掌葉大黃或越桔的提取物（一種或多種）制備的混合組合物也顯示了 2至最大10倍的 優(yōu)秀的高級糖化終末產(chǎn)物。
[0100] 實驗實施例2:斑馬魚中對于抗糖尿病并發(fā)癥的效果的分析
[0101] 為了證實C0PH抗糖尿病并發(fā)癥的效果，使用斑馬魚胚胎執(zhí)行實驗以檢查對玻璃 體的血管直徑擴張的抑制效果。
[0102] 1)制備斑馬魚的發(fā)育胚胎和藥物治療
[0103] 使用高糖（30mM葡萄糖）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的斑馬魚（Tg(kdr:EGFP))的發(fā)育胚胎以 患有糖尿病，其中轉(zhuǎn)基因的斑馬魚的發(fā)育胚胎在血管內(nèi)皮細胞中能夠表達熒光蛋白。以 1. 0 yg/mL、5.0 yg/mL和10. 0 yg/mL的濃度的C0PH給藥所得物，并檢驗效果。
[0104] 2)分析玻璃體的血管變化
[0105] 在利用高糖處理/固定（fixing)5日后，分離晶狀體并分析玻璃體的血管變化。顯 示C0PH治療組顯著抑制血管直徑的擴張（圖1)。在表2中顯示對血管直徑擴張的抑制率。
[0106]【表2】
[0107]
[0108] 實驗實施例3:在STZ-誘導(dǎo)型糖尿病動物模型中對糖尿病性視網(wǎng)膜水腫和糖尿病 性腎病變的效果的分析
[0109] 1)實驗動物
[0110] 使六周齡雄性SD大鼠適應(yīng)一周，使用STZ誘導(dǎo)以患有糖尿病，并使得到的高糖 (高于350mg/dL)鼠經(jīng)受實驗。將實驗組分為正常組（N0R)、糖尿病組（DM)、以25mg/kg/天 的C0PH治療組（C0PH-25)和以50mg/kg/天的C0PH治療組（C0PH-50)。每日給每一組口服 給藥C0PH，持續(xù)三周。
[0111] 2)抑制血液-視網(wǎng)膜屏障破損的效果
[0112] 三周后，從每一組隨機選擇八只大鼠，從它們分離視網(wǎng)膜，并分析自視網(wǎng)膜血管的 滲漏（leakage)。麻醉后，將熒光素-葡聚糖和H 〇eChst33342注入每只小鼠的左心室。5 分鐘后摘出眼球并分離視網(wǎng)膜。將分離的視網(wǎng)膜固定在載玻片上并在熒光顯微鏡下觀察。 對于定量分析，將熒光素-葡聚糖注入左心室，并收集心臟血，并通過灌注移出剩余的熒光 素-葡聚糖，摘出眼球然后分離視網(wǎng)膜。將如此分離的視網(wǎng)膜勻漿并通過熒光分光光度計 僅從上清液測量FITC葡聚糖的量。
[0113] 如圖2所示，注入血管的熒光材料在N0R組中沒有滲漏，但在DM組中，由于血 液-視網(wǎng)膜屏障破損，隨著時間由血管滲漏出的熒光材料的量增加，因此引起視網(wǎng)膜組織 被明亮地觀察到。相反，在C0PH治療組中，以劑量依賴的方式顯著地抑制熒光滲漏現(xiàn)象（圖 2a)。另外，甚至在定量分析的結(jié)果中，在C0PH治療組中在視網(wǎng)膜中剩余的額熒光材料的量 以劑量依賴的方式顯著地減少（圖2b)。從這些結(jié)果，證實了 C0PH具有優(yōu)異的預(yù)防和治療 糖尿病性視網(wǎng)膜病的效果。
[0114] 3)抑制糖尿病性腎病變的效果
[0115] 為了驗證預(yù)防（治療）腎病變的效果，分析蛋白尿和尿中的高級糖化終末產(chǎn)物 (AGE)和8-OHdG的量，8-OHdG為氧化應(yīng)激標記物。
[0116] 在移除于每周自每組收集的尿中存在的雜質(zhì)后，使用Bio-Rad試劑盒（Bio-Rad Laboratories Inc, USA)根據(jù)Bradford方法定量蛋白質(zhì)的濃度。
[0117] 在尿中，通過ELISA測量白蛋白、高級糖化終末產(chǎn)物（AGE)、作為氧化應(yīng)激標記物 的8-OHdG和突觸足蛋白的量（圖3)。
[0118] 如圖3所示的，相比于N0R組，從糖尿病發(fā)作的六周內(nèi)，DM組顯示所有三種新的功 能標記物顯著更高的增加。相反，C0PH治療組顯示以劑量依賴的方式顯著地降低，因此暗 示C0PH具有對糖尿病性腎病變的預(yù)防性效果。
[0119] 實驗實施例4:db/db小鼠（2型糖尿病）動物模型中對糖尿病性眼病的效果的分 析
[0120] 為了驗證實施例1和實施例3中分別制備的組合物C0PH和（C0PH+MET)對2型糖 尿病性db/db小鼠模型中糖尿病性眼病的效果，每日為小鼠口服給藥組合物，持續(xù)12周。 相關(guān)的實驗組如下給藥：NOR組、DM組、甲福明（350mg/kg)治療組（MET-350)、C0PH(25mg/ kg)治療組（COPH-25)、C0PH(50mg/kg)治療組（C0PH-50)和混合物[C0PH(50mg/ kg) +MET (350mg/kg)]治療組（（C0PH-50) + (MET-350))。
[0121] 1)抑制血液-視網(wǎng)膜屏障破損的效果的分析
[0122] 腹部麻醉后，將熒光素-葡聚糖注入小鼠的左心室，并從眼球分離視網(wǎng)膜。將如此 分離的視網(wǎng)膜固定在載玻片上，干燥，并通過在熒光顯微鏡下觀察和染色法分析各自的熒 光材料（圖4)和血清白蛋白（圖5)的滲漏程度，由此驗證預(yù)防和治療血液-視網(wǎng)膜屏障 破損的效果。
[0123] 如圖4所示的，N0R組顯示沒有滲漏現(xiàn)象，而在DM組中，由于血液-視網(wǎng)膜屏障破 損，在大多數(shù)小鼠中熒光材料由血管滲漏出來并積累，因此使它們比N0R組更明亮。同時， 甲福明治療組（MET)顯示熒光材料的滲漏并且亮度相比DM組的亮度降低。在C0PH治療組 中，由于熒光材料滲漏造成的亮度以劑量依賴的方式降低，并且尤其是，高劑量C0PH治療 組顯示熒光材料滲漏的顯著降低。另外，（C0PH+MET)混合物治療組顯示最優(yōu)異的抑制效果， 因此暗示最優(yōu)異的抑制效果是由于C0PH和甲福明的協(xié)同作用。
[0124] 另外，如圖5所示的，在DM組中，白蛋白由血管滲漏出來并以模糊（hazy)的棕色 使相鄰區(qū)域染色（箭頭）。然而，高劑量C0PH治療組和（C0PH+MET)混合物治療組沒有顯示 上面的現(xiàn)象。
[0125] 2)免疫組織化學染色分析
[0126] 通過免疫組織化學染色分析驗證抑制間質(zhì)緊密連接蛋白中的損壞、抑制基質(zhì)金屬 蛋白酶-2的表達、抑制高級糖化終末產(chǎn)物的積累和抑制血管內(nèi)皮生長因子的形成的效果 (圖6至9)。
[0127] (1)對間質(zhì)緊密連接蛋白抑制損壞的效果的分析
[0128] 如圖6所示的，DM組顯示在多個血管（箭頭）中閉塞的絲球狀（skein-like)連接 線被切斷。然而，C0PH治療組和（C0PH+MET)混合物治療組顯示預(yù)防（治療）閉塞的損失。
[0129] (2)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP2)表達的效果的分析
[0130] 如圖7所示的，DM組顯示MMP2 (箭頭）的表達增加，而在C0PH治療組和 (C0PH+MET)混合物治療組中MMP2的表達被抑制。
[0131] (3)抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)高級糖化終末產(chǎn)物形成的效果的分析
[0132] 如圖8所示的，相比于N0R組，DM組顯示大約2倍高的高級糖化終末產(chǎn)物的形成， 而C0PH治療組和（C0PH+MET)混合物治療組顯著抑制高級糖化終末產(chǎn)物的形成。
[0133] (4)抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)形成的效果的分析
[0134] VEGF誘導(dǎo)新血管化并增加血管的滲透性。另外，VEGF還誘導(dǎo)基質(zhì)降解蛋白的形 成。因此，證實了 C0PH治療組和（C0PH+MET)混合物治療組抑制血管滲透性是由于抑制血 管內(nèi)皮生長因子的形成（圖9)。
[0135] 如圖9所示的，DM組明顯地增加視網(wǎng)膜組織內(nèi)的VEGF的形成，并且C0PH治療組、 MET組和（C0PH+MET)混合物治療組顯著抑制VEGF的表達。
[0136] 3)抑制無細胞毛細血管形成的效果的分析
[0137] 糖尿病性視網(wǎng)膜病的早期癥狀之一是由于無細胞毛細血管形成相鄰周細胞的細 胞核凋亡，由此進展為視網(wǎng)膜病。在從眼球摘出視