物藥理活性相似。
[0025] 實施例7 :提取物藥理試驗 一、材料與方法 1. 1藥物：土瓜提取物①~⑤分別按照實施例1~5制得。秋水仙堿片，批號100206,規(guī) 格0. 5mg/s，西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司；取6片秋水仙堿，研磨，加蒸餾水至200mL，混 勻配制成濃度為0. 15mg/mL秋水仙堿溶液。微晶尿酸鈉（MSU)，參照Coderre方法，194mL蒸 餾水加6mLlmol/LNaOH，煮沸，加lg尿酸，用lmLlmol/LHC1調(diào)pH至7. 2,攪拌冷卻，4°C冰 箱保存24h，去上清，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入70°C干燥箱烘2h，取出，刮下粉末，放 入研缽內(nèi)研成細末，用孔徑250ym的金屬篩過篩，制成MSU粉末備用。
[0026] 1. 2試劑：尿酸（UA)試劑盒，批號：P100121，上海復星長征醫(yī)學科學有限公司；一 氧化氮（N0)試劑盒，批號：20110119,南京建成生物工程研究所；總蛋白（TP雙縮脲法)試劑 盒，批號：110601，北京?；闵锟萍及l(fā)展有限公司。
[0027] 1. 3動物：清潔級SD大鼠，雄性，體重200~220g，由浙江省醫(yī)學科學院提供，合格 證號：SC)(K(浙）20080033。
[0028] 1.4儀器：LP123電子天平，常熟市衡器廠，蘇制00000153 ;YLS-7A大鼠足趾容 積測量儀，山東省醫(yī)學科學院設備站；HEMAVET950動物血液分析儀，ADrewScientific GroupCo;威圖SELECTRA-E全自動生化儀，荷蘭威圖公司。
[0029] 1. 5實驗方法及檢測指標 1. 5. 1動物分組及給藥：將大鼠隨機分為18組：正常對照組、模型對照組、陽性對照組 (秋水仙堿〇? 〇〇15g?kgb、土瓜提取物①~⑤各設3個劑量組（100mg?kg\200mg?kg\ SOOmg^kg1)，每組10只。造模前給藥5d，l次/d，造模后繼續(xù)給藥。受試藥組分別灌胃給 予不同劑量的土瓜提取物，正常對照組灌胃給予相應體積的水，陽性對照藥灌胃給予相應 劑量的秋水仙堿藥液。
[0030] 1. 5. 2造模：取lOOOrngMSU加9mL生理鹽水，再加lmL吐溫-80,加熱攪拌，配制成 10mLMSU混懸液(濃度為100mg?mL給藥30min后大鼠右后踝關節(jié)屈曲，用手觸摸可扣 及兩骨突部，75%醫(yī)用酒精局部消毒后，用6號注射針在左右后側(cè)踝關節(jié)背側(cè)從45°方向插 入脛骨肌腿內(nèi)側(cè)，將〇.lmLMSU混懸液注入到踝關節(jié)腔，制備急性痛風性關節(jié)炎模型，伸曲、 旋轉(zhuǎn)運動2min，正常對照組大鼠用無菌生理鹽水代替MSU混懸液。
[0031] 1. 5. 3關節(jié)腫脹度：造模前在大鼠右后足踝關節(jié)三叉處外部繞踝關節(jié)用記號筆畫 圈做記號，測量大鼠右足至標記處排水容積兩次，取平均值為給藥前關節(jié)體積；造模后lh、 4h、6h、24h測量大鼠右足至標記處排水容積，按公式計算腫脹度。
[0032] 腫脹度（mL)=致炎后踝關節(jié)排水容積（mL) -致炎前踝關節(jié)排水容積（mL)。
[0033] 1. 5. 4血液分析：造模24h，末次給藥30min后，測完指定部位的排水容積后，從大 鼠眼眶后靜脈叢采血5mL，其中4mL室溫下自然凝血2h，3500r?min1離心10min，吸取血清， 參照試劑盒說明書依法測定血清UA、N0含量；另lmL加10yLEDTA抗凝，使用動物血液分 析儀依法測定白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)量。
[0034] 1. 5. 5生化及組織學指標：在玻璃紙上用銳利的刀片從大鼠右踝關節(jié)背側(cè)快速切 斷筋膜，切取踝關節(jié)三叉處除骨的全部軟組織及軟骨，稱重并加9倍量的冰生理鹽水制成 10%組織勾衆(zhòng)，3500r?min1離心lOmin，吸取上清，參照試劑盒說明書依法測定總蛋白、NO 含量；處死取脾臟、腎臟，稱重，計算脾體系數(shù)和腎體系數(shù)。
[0035] 1. 6統(tǒng)計分析：計量資料數(shù)據(jù)結果以x±s表示，組間比較采用t檢驗。
[0036]二、結果 2. 1 土瓜提取物對痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)腫脹度的影響 與正常對照組相比，模型對照組大鼠踝關節(jié)腫脹度在造模后1~6h內(nèi)均顯著升高 (P〈0. 01);造模后lh，與模型對照組相比，秋水仙堿組、土瓜提取物①~③各劑量組大鼠踝 關節(jié)腫脹度均顯著下降（P〈〇. 01);造模后4h，與模型對照組相比，秋水仙堿組、土瓜提取物 ①~③各劑量組大鼠踝關節(jié)腫脹度均顯著下降（P〈〇. 01);造模后6h，與模型對照組相比，秋 水仙堿組、土瓜提取物①~③高劑量組大鼠踝關節(jié)腫脹度均顯著下降（P〈〇. 05) ;土瓜提取 物①~③中、低劑量組大鼠踝關節(jié)腫脹度亦有降低的趨勢；土瓜提取物④~⑤各劑量組在造 模24h內(nèi)與模型組相比均無顯著差異。結果見表1(注：與模型組比較，*P〈0. 05，**P〈0. 01)。
[0037] 表1 土瓜提取物在造模24h內(nèi)對痛風性關節(jié)炎大鼠踝關節(jié)腫脹度的影響（x土s， n=10)
2. 2對痛風性關節(jié)炎大鼠脾體指數(shù)、腎體指數(shù)的影響 與正常對照組相比，模型組腎體指數(shù)明顯降低，脾體指數(shù)明顯升高（P〈〇. 05、0. 01);與 模型對照組相比，秋水仙堿組大鼠腎體指數(shù)顯著升高，脾體指數(shù)顯著降低（P〈〇. 05) ;土瓜提 取物①~③高劑量組腎體指數(shù)明顯上升（P〈〇. 01 )，土瓜提取物①~③各劑量組脾體指數(shù)均 有不同程度的下降（P〈〇. 05、0. 01);土瓜提取物④~⑤各劑量組對大鼠脾體指數(shù)、腎體指數(shù) 的影響與模型組無顯著差別。見表2 (注：與模型對照組比較，*P〈0. 05, **P〈0. 01)。
[0038] 表2 土瓜提取物對痛風性關節(jié)炎大鼠脾指數(shù)、腎指數(shù)的影響（x土s，n=10)
2. 3對痛風性關節(jié)炎大鼠全血中白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞水平的影響 與正常對照組相比，模型對照組的白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量有升高的趨勢； 與模型組相比秋水仙堿和土瓜提取物①~③高劑量組大鼠的白細胞、中性粒細胞合淋巴細 胞數(shù)量明顯減少（P〈〇. 05、0. 01)，土瓜提取物①~③其余各劑量組均有降低趨勢；土瓜提取 物④~⑤各劑量組與模型對照組比無顯著差異。見表3 (注：與模型對照組比較，*P〈0. 05， **P〈0.01)。
[0039]表3 土瓜提取物對痛風性關節(jié)炎大鼠白細胞、中性粒細胞及淋巴細胞影響（x土s， n=10)
2. 4對痛風性關節(jié)炎大鼠血清UA水平的影響 各組大鼠血尿酸值結果結果顯示，與正常對照組相比，模型組血尿酸值明顯升高 (P〈0. 05);與模型組相比，土瓜提取物①~③中高劑量組大鼠血尿酸明顯下降（P〈0. 05); 土瓜提取物④~⑤各劑量組與模型組比均無顯著性差異。見表4 (注：與模型對照組比較， *P〈0. 05, #P〈0. 01)。
[0040] 表4 土瓜提取物對痛風性關節(jié)炎大鼠血清UA的影響（x土s，n=10)
上述試驗結果表明，土瓜提取物對大鼠痛風性關節(jié)炎具有治療作用。土瓜提取物中菊 花的含量對其發(fā)揮治療作用至關重要。
[0041] 實施例8:片劑的制備 按實施例1方法制得提取物，按其與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制粒壓 片。
[0042] 實施例9 : 口服液的制備 按實施例1方法先制得提取物，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
[0043] 實施例10 :膠囊劑或顆粒劑的制備 按實施例1方法先制得提取物，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠 囊或顆粒劑。
[0044] 實施例11 :注射液的制備 按實施例1方法制得提取物，加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
[0045] 實施例12 :無菌粉針的制備 按實施例1方法先制得提取物，溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過 濾，再無菌精濾，分裝于安瓿，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。
【主權項】
1. 一種土瓜提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制備： (a)以重量計，每100份藥材包含干燥的土瓜80~90份和干燥的菊花10~20份，混合粉 碎，用55%乙醇溶液熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液；（b)將步 驟（a)所得乙醇提取濃縮液用水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，減 壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（c)正丁醇萃取物用水 溶解，過濾，用大孔樹脂富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積除去大極性成分，再用 70%乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮即得。2. 根據(jù)權利要求1所述的提取物，其特征在于：步驟（c)中所述大孔樹脂為AB-8型大 孔樹脂。3. 根據(jù)權利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法為： 色譜柱：AgilentZorbaxExtent_C18 柱（4.6mmX250mm，5iim); 流動相：A為乙腈，B為0. 5%磷酸溶液； 梯度洗脫程序：〇? 〇l~5min，A10% - 15% ;5~10min，A15% - 48% ;10~25min，A48% - 78% ;25~30min，A78% - 10% ; 流動相流速：1.OmL?minS 檢測波長：270nm; 柱溫：35°C; 進樣量：10yL。4. 藥物制劑，其特征在于：含有治療有效量的權利要求1所述的提取物和藥學上可接 受的載體。5. 權利要求1所述的提取物在制備治療痛風性關節(jié)炎的藥物中的應用。6. 權利要求4所述的藥物制劑在制備治療痛風性關節(jié)炎的藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療痛風性關節(jié)炎的土瓜提取物，提取物制備方法包括：（a）以重量計，每100份藥材包含干燥的土瓜80~90份和干燥的菊花10~20份，混合粉碎，用55%乙醇溶液熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液；（b）將步驟（a）所得乙醇提取濃縮液用水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（c）正丁醇萃取物用水溶解，過濾，用大孔樹脂富集活性成分，先用10%乙醇沖洗8個柱體積除去大極性成分，再用70%乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮即得。該提取物可以應用于痛風性關節(jié)炎，開發(fā)成治療痛風性關節(jié)炎的藥物。
【IPC分類】A61P19/06, A61P19/02, G01N30/02, A61K36/39
【公開號】CN105168305
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李 杰
【申請人】李 杰
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月7日