一種八肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥與化妝品等領(lǐng)域，具體涉及一種八肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型是評(píng)價(jià)樣品是否具有抗氧化能力的常用方法，而紅細(xì)胞來 源豐富、取材方便，是體外生物實(shí)驗(yàn)中的常用材料。自由基首先攻擊紅細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋 白質(zhì)，使細(xì)胞膜破損，釋放出紅細(xì)胞中的血紅蛋白，稱為紅細(xì)胞溶血。AAPH、H 2O2和Hemin為 常用的誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的物質(zhì)?；钚詷悠返念A(yù)處理，可以起到抑制紅細(xì)胞溶血的作用，從而 該模型通過測(cè)定紅細(xì)胞溶血抑制率和細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活性來評(píng)價(jià)樣品的細(xì)胞內(nèi)抗 氧化效果。原子力顯微鏡（AFM)是一種高分辨率的新型成像工具，在生物醫(yī)學(xué)界已被廣泛 用于細(xì)胞形貌及其超微結(jié)構(gòu)的表征，其原理是通過檢測(cè)探針掃描樣品時(shí)所產(chǎn)生的原子間相 互作用力來獲得樣品形貌結(jié)構(gòu)信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理成像。自由基攻擊細(xì)胞膜使之結(jié)構(gòu) 和功能喪失，發(fā)生細(xì)胞溶血。這一結(jié)論通過用原子力顯微鏡（AFM)觀察對(duì)照組、損傷組和保 護(hù)組紅細(xì)胞形貌得到進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0003] 光老化是外界環(huán)境對(duì)皮膚的生物學(xué)應(yīng)答的效果。皮膚對(duì)光老化的應(yīng)答通常與正常 的水合作用的缺乏、皮膚下垂以及線條和皺紋外觀有關(guān)。UVB照射可使成纖維細(xì)胞內(nèi)活性 氧（reactive oxygen species，R0S)堆積，超過了其清除能力，打破氧化與抗氧化平衡，發(fā) 生氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)一系列程序化的細(xì)胞反應(yīng)，甚至調(diào)控衰老相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞 衰老的發(fā)生。大量研究表明ROS在細(xì)胞內(nèi)的堆積是皮膚光老化發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán) 節(jié)。人皮膚成纖維細(xì)胞是人皮膚產(chǎn)膠原蛋白的主要場(chǎng)所，其數(shù)量的多少和細(xì)胞膠原蛋白的 產(chǎn)率與皮膚衰老狀態(tài)息息相關(guān)。因此，人皮膚成纖維細(xì)胞的存活率和膠原蛋白的產(chǎn)率是被 廣泛應(yīng)用認(rèn)可的一種評(píng)價(jià)皮膚衰老狀態(tài)的模型。
[0004] 生物活性肽具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗 菌、降血壓、抗癌、抗氧化等功效，是由25個(gè)天然氨基酸通過肽鍵以不同組成和排列方式構(gòu) 成的二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱?；钚噪陌踩詷O高，是當(dāng)前國(guó)際食品 界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作 用后并不完全以游離氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游離氨基酸 具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物效價(jià)。雖然，活性肽被廣泛應(yīng)用在化妝品中，但是，本發(fā)明中的 序列是首次發(fā)現(xiàn)，并具備該功效的多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供了一種具有保護(hù)紅細(xì)胞溶血以及促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的 增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的八肽，可應(yīng)用于生物制藥與化妝品等領(lǐng)域。
[0006]本發(fā)明一種八肽的序列為：Ala-Asn-Ala-Ala-Phe-Arg-Pro-Arg，縮寫為 ANAAFRPR，分子量 902. 6。其中， Ala表示英文名稱為Alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Asn表示英文名稱為Asparagine，中文名稱為天冬酰胺的相應(yīng)殘基； Phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Arg表示英文名稱為Arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基 Pro表示英文名稱為proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基，本發(fā)明的多肽 使用多肽合成儀，采用固相合成法合成。。
[0007] 本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標(biāo)多肽的C-端羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以這 個(gè)氨基酸的氨基作為起點(diǎn)，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過程，即 可以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護(hù)基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn) 物。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0008] 本發(fā)明將終濃度為1-100 Pg/mL的八肽與正常人血紅細(xì)胞混勻，孵育，經(jīng)終濃度 為100 mM AAPH損傷2 h后，使得細(xì)胞溶血抑制率達(dá)到83. 83±0. 72%。用5噸/mL的合成 多肽處理后的與僅用AAPH損傷的紅細(xì)胞組相比，紅細(xì)胞SOD活性由2. 5976 mgprot/mL上 升到5. 5791 mgprot/mL，結(jié)果表明，合成多肽(八肽)處理后紅細(xì)胞的SOD活性有較大提高， 將為其在生物醫(yī)藥與化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。
[0009] 本發(fā)明將濃度為1-10 Pg/mL的合成多肽(八肽）加入人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 液中孵育，經(jīng)中波紫外（UVB ) 80mJ/cm2損傷48-72 h后后，使得細(xì)胞存活率最高提高了 0-18. 18%。同時(shí)，膠原蛋白得率由模型組的11. 9512±1. 2067 噸/mL上升為合成多肽組的 13. 2439±1. 3433 噸/mL，膠原蛋白得率提高了 4. 69-10. 82%。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果： 本發(fā)明首次合成了該肽，并且應(yīng)用于AAPH損傷的正常人紅細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，使得紅細(xì)胞 溶血率顯著降低，SOD活性有較大的提高，同時(shí)，合成多肽對(duì)紫外損傷的人皮膚成纖維細(xì)胞 的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，同時(shí)能促進(jìn)其膠原蛋白的產(chǎn)生。
【附圖說明】
[0011]圖 1 為合成多肽Ala-Asn-Ala-Ala-Phe-Arg-Pro-Arg的 ESI-MS 圖譜。其中橫坐 標(biāo)為m/z (質(zhì)荷比值）、縱坐標(biāo)為intensity(信號(hào)強(qiáng)度）。
[0012] 圖2為合成多肽添加后進(jìn)行AAPH損傷的正常人紅細(xì)胞溶血抑制率變化曲線。
[0013] 圖3a-圖3c為不同處理組紅細(xì)胞的原子力顯微鏡（AFM)成像圖，其中圖3a為 正常紅細(xì)胞，圖3b為IOOmM的AAPH處理2h的紅細(xì)胞，圖3c為用lOOPg/mL的合成肽 Ala-Asn-Ala-Ala-Phe-Arg-Pro-Arg 預(yù)處理 20min 之后再加 IOOmM AAPH 培養(yǎng) 2 h 的紅 細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不 限于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0015] 多肽(八肽）固相合成：選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列 Ala-Asn-Ala-Ala-Phe-Arg-Pro-Arg的特征，先將Phe的羧基以共價(jià)鍵的形式與一個(gè)樹脂 相連，然后Phe的氨基和Phe的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加Glu，Phe的氨基和Glu的羧 基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個(gè)Phe氨基酸后，再切除樹脂即得到目標(biāo)多 肽。采用高效液相色譜進(jìn)行純化，色譜柱型號(hào)為Phenomenex C18，尺寸4. 6*150mm，流動(dòng)相 A:含有0. 1%三氟乙酸（TFA)的水；流動(dòng)相B:含有0. 09%TFA的溶液（80%乙腈+20%水）； 20 min內(nèi)B相由14. 0%上升到24. 0%，流速I. 0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。液氮速凍，冷凍 干燥，得到最后的產(chǎn)品，要求純度達(dá)到95%以上，并經(jīng)ESI-MS鑒定結(jié)構(gòu)（如圖1所示)。本 發(fā)明以APPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)以及紫外損傷人皮膚成纖維細(xì)胞來評(píng)價(jià)多肽的抗氧化 及抗皮膚衰老活性。
[0016] 合成多肽對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞UVB損傷的保護(hù)應(yīng)用 人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中，完全培養(yǎng)基主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)基高糖DMEM， 10%胎牛血清（v/v)，以及1%雙抗（由青霉素和鏈霉素組成，v/v)組成。置于37 °C、CO2 體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中。每隔2 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的90%左右， 取其接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 y L，濃度為5X 104cells/mL。細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后， 吸棄培養(yǎng)液，用200 yL PBS洗1次，加入200 yL PBS，用80 mj/cm2 UVB照射，吸棄PBS，每 孔加入200 y L樣品（零濃度用高糖DMEM取代，即為正常對(duì)照），繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸棄培養(yǎng) 液，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果見表1。
[0017]表 1
合成多肽提高UVB損傷人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白產(chǎn)生的應(yīng)用 取上述處理組的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，用無菌水洗細(xì)胞表面兩次，加入冰冷體積百分比濃 度為70%乙醇200 y L進(jìn)行固定，在-80°C冰箱放置至少lOmin，取出后，用無菌水洗細(xì)胞表 面兩次，風(fēng)干水分后，每孔加入200 y L 1%飽和苦味酸-猩紅染液(m/v)，于4°C條件下輕 晃24 h，吸棄染液，用無菌水洗3次，直至沒有染色液洗出為止，加入150 y L IM NaOH溶液， 150 r/min，震蕩15 min，每孔取出10〇1^置于96孔板中，測(cè)定492111]1處的吸光度值，結(jié)果 見表2。
[0018]表 2
合成多肽對(duì)正常人紅細(xì)胞AAPH損傷的保護(hù)應(yīng)用 用含有檸檬酸鈉的抗凝管（抗凝