劑檸檬酸鈉：血液=1 :9，v/v)抽取健康成人（30歲以 下）血液放于4°C冰箱保存，一周內(nèi)使用。臨用時，將血液放在離心管中于1500 g離心12 min，移去上層的血漿，紅細(xì)胞用PBS (pH=7. 4)洗2-3次，直至上清液為無色。最后于離心 機(jī)中1500 g離心12 min，移除上清液，得到緊密的紅細(xì)胞壓積，用PBS稀釋成體積濃度為 20%的紅細(xì)胞懸液。單獨(dú)用100 yg/mL的合成多肽處理紅細(xì)胞，以0.1 mL 20%紅細(xì)胞懸 液和0.3 mL PBS共同孵育2 h作為空白對照組，確定樣品不具有溶血性。
[0019] 應(yīng)用實(shí)施例1 0.1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為0 yg/mL的合成多肽(用PBS取代，即為模 型組）預(yù)處理20 min后，加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育 2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min， 取上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混 合物作為全溶血對照，計算溶血率。（結(jié)果見圖2)同時，將各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500 g 離心12 min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上清液，再次重懸。制片時，取10 y L 紅細(xì)胞重懸液均勻涂于潔凈的云母片上(要求細(xì)胞無重疊、不團(tuán)聚)，然后用2. 5% (體積，v/ V)的戊二醛固定細(xì)胞，5 min后，用超純水沖洗娃片3次，自然風(fēng)干娃片，最后置于原子力顯 微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細(xì)胞形貌，用NanoScope軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖3a。
[0020] 應(yīng)用實(shí)施例2 0.1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為5 yg/mL的合成多肽預(yù)處理20 min后，加 入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶 液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中，用 酶標(biāo)儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對照，計算 溶血率，結(jié)果見圖2。
[0021] 應(yīng)用實(shí)施例3 0.1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為25 yg/mL的合成多肽預(yù)處理20 min后， 加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物 溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中， 用酶標(biāo)儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對照，計 算溶血率(結(jié)果見圖2)。
[0022] 圖2為合成多肽添加后進(jìn)行AAPH損傷的正常人紅細(xì)胞溶血抑制率變化曲線。其 中橫坐標(biāo)為Concentration (濃度）、縱坐標(biāo)為Hemolysis inhibition (溶血抑制率）。結(jié) 果表明，加入體系中合成多肽濃度為5|ag/mL時，紅細(xì)胞溶血抑制率顯著高于模型組，濃度 達(dá)到25Pg/mL后，直到lOOPg/mL，溶血抑制率不再升高。
[0023] 應(yīng)用實(shí)施例4 0.1 mL 20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為100 yg/mL的合成多肽預(yù)處理20 min后， 加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物 溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中， 用酶標(biāo)儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對照，計 算溶血率。（結(jié)果見圖2)同時，將各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500 g離心12 min，收集細(xì)胞 沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上清液，再次重懸。制片時，取10 y L紅細(xì)胞重懸液均勻涂 于潔凈的云母片上(要求細(xì)胞無重疊、不團(tuán)聚)，然后用2. 5%的戊二醛固定細(xì)胞，5 min后，用 超純水沖洗硅片3次，自然風(fēng)干硅片，最后置于原子力顯微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細(xì) 胞形貌，用NanoScope軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(結(jié)果見圖3b)。
[0024] 應(yīng)用實(shí)施例5 0.1mL20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0.1mL濃度為0yg/mL(用PBS取代，即為正常對照組） 的合成多肽預(yù)處理20 min后，加入0. 2 mL終濃度為0 mM的AAPH溶液(用PBS取代， 即為正常對照)，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶液50 yL用PBS緩沖液稀 釋至ImL，1500g離心12 min，取上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在540 nm處測其吸光 度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對照，計算溶血率，（結(jié)果見圖2);同時，將 各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500g離心12 min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上 清液，再次重懸。制片時，取10 y L紅細(xì)胞重懸液均勻涂于潔凈的云母片上(要求細(xì)胞無重 疊、不團(tuán)聚)，然后用2. 5%的戊二醛固定細(xì)胞，5 min后，用超純水沖洗硅片3次，自然風(fēng)干硅 片，最后置于原子力顯微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細(xì)胞形貌，用NanoScope軟件分析實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖3c。
[0025] 圖3a-圖3c中其中圖3a為正常紅細(xì)胞，圖3b為100 mM的AAPH處理2 h的紅 細(xì)胞，圖 3c 為用 100 Mg/mL 的合成肽 Ala-Asn-Ala-Ala-Phe-Arg-Pro-Arg預(yù)處理 20 min 之后再加100 mM AAPH培養(yǎng)2 h的紅細(xì)胞。結(jié)果表明，正常紅細(xì)胞具有典型的雙凹面結(jié) 構(gòu)，細(xì)胞表面光滑，四周高度基本一致。AAPH處理組細(xì)胞表面變得粗糙，細(xì)胞嚴(yán)重塌陷，高度 降低，形狀不規(guī)則。合成多肽預(yù)處理的保護(hù)組，細(xì)胞損傷程度明顯減弱，四周與中間的高度 差明顯，呈現(xiàn)餅狀結(jié)構(gòu)。
[0026] 應(yīng)用實(shí)施例6 0.1mL20%紅細(xì)胞懸液經(jīng)0.1mL濃度為0yg/mL(用PBS取代，即為正常對照組） 的合成多肽預(yù)處理20 min后，加入0. 2 mL終濃度為0 mM的AAPH溶液(用PBS取代， 即為正常對照)，微震、避光孵育2 h，將各處理組細(xì)胞用離心機(jī)于1500 g離心12 min，收 集細(xì)胞沉淀，用PBS洗3次離心，加入4°C預(yù)冷的超純水，150r/min震蕩lOmin，1000 Og離心 30min，收集上清液備用，按照試劑盒(南京建成)的說明書進(jìn)行測定其中的SOD活性，結(jié)果見 表3〇
[0027]表 3
本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí) 施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它 不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神 和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種八肽，其特征在于，所述八肽的氨基酸序列為Ala-Asn-Ala-Ala-Phe-Arg-Pro- Arg02. 權(quán)利要求1所述八肽的應(yīng)用，其特征在于，將濃度為1-100 呢/mL的所述八肽與紅 細(xì)胞混合，在終濃度為100mMAAPH的作用下，孵育2h后，使得紅細(xì)胞溶血率降低，其形貌 比單純AAPH處理組光滑，有序。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述紅細(xì)胞溶血率為83. 83±0. 72%。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述紅細(xì)胞SOD活性由2. 5976mgprot/ mL上升到 5. 5791mgprot/mL〇5. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將濃度為1-10Pg/mL的合成八肽混合人皮膚 成纖維在UVB的作用下，孵育48-72h后，使得細(xì)胞存活率提高了 0-18. 18%，同時，膠原蛋白 得率提尚了 4.69_10.82%。6. 權(quán)利要求5所述合成多肽的應(yīng)用，其特征在于，所述UVB為80mJ/cm2。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種八肽及其應(yīng)用。所述八肽的氨基酸序列如下所示：Ala-Asn-Ala-Ala-Phe-Arg-Pro-Arg。將此合成八肽應(yīng)用于對AAPH損傷的健康成年人的紅細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，細(xì)胞溶血抑制率達(dá)到83.83±0.72%，細(xì)胞SOD活性有顯著的提高，并且形態(tài)有一定的恢復(fù)。將1-10μg/mL的該八肽應(yīng)用于UVB損傷的人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，使得細(xì)胞存活率提高了0-18.18%。同時，膠原蛋白得率提高了4.69-10.82%。發(fā)明的目的是提供了一種具有抑制紅細(xì)胞溶血以及促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白產(chǎn)生的合成八肽，可應(yīng)用于生物制藥與化妝品等領(lǐng)域。
【IPC分類】A61K8/64, C07K7/06, A61P17/16, A61Q19/00, A61K38/08
【公開號】CN105175497
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】張學(xué)武, 曾巧輝
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月28日