一種十五肽及其應(yīng)用
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物制藥與化妝品等領(lǐng)域，具體涉及一種合成十五肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 生物活性肽是具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、 抗菌、降血壓、抗癌、抗氧化等作用的二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱，由25 個天然氨基酸通過肽鍵以不同組成和排列方式構(gòu)成?；钚噪陌踩詷O高，是當(dāng)前國際食品 界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作 用后并不完全以游離氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游離氨基酸 具有更高的營養(yǎng)價(jià)值和生物效價(jià)。
[0004] 樣品清除自由基的能力是評價(jià)其抗氧化活性最常見的方法。自由基與人類的衰老 和某些病理過程密切相關(guān)，它們都帶有不成對的單電子，攻擊體內(nèi)細(xì)胞，破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì) 及DNA結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致機(jī)體功能的缺失和疾病的發(fā)生。清除體內(nèi)過量的自由基在預(yù)防某些 疾病的過程中具有重要作用。
[0005] ABTS，2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽，是一種水溶性物質(zhì)， 可被MnO2氧化為比較穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS自由基，此自由基在736 nm有穩(wěn)定的最大吸收 峰，抗氧化劑能夠提供氫原子將自由基還原為無色ABTS，可根據(jù)溶液在736 nm處的吸光 度變化來評估抗氧化劑清除ABTS+的能力。DPPH (1，1-二苯基-2-苦肼基）是一種醇溶性 物質(zhì)，在醇溶液中生成以氮原子為中心的穩(wěn)定自由基、并呈深紫色，該自由基在522 nm處 有最大吸收峰，加入抗氧化樣品后，溶液會褪色，可以通過其吸光值的變化來檢測樣品的抗 氧化活性。FRAP 方法（Ferric reducing antioxidant potential Assay)是測定物質(zhì)抗 氧化能力的一種方法。原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Ferric-tripyridyltriazine (Fe 3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ,隨后在596 nm測定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中 的總抗氧化能力。以上三種模型操作簡便、快捷、可控性好得到廣泛應(yīng)用。
[0006] 構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型是評價(jià)樣品是否具有抗氧化能力的常用方法，而紅細(xì)胞由 于來源豐富、取材便易，可以作為一種簡單的異相介質(zhì)的代謝模型，是體外生物實(shí)驗(yàn)中的常 用材料。自由基首先攻擊紅細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞膜破損，釋放出紅細(xì)胞中的血 紅蛋白，稱為紅細(xì)胞溶血。AAPH、H 2O2和Hemin為常用的誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的物質(zhì)。
[0007] 原子力顯微鏡（AFM)是一種高分辨率的新型成像工具，在生物醫(yī)學(xué)界已被廣泛用 于細(xì)胞形貌及其超微結(jié)構(gòu)的表征，其原理是通過檢測探針掃描樣品時所產(chǎn)生的原子間相互 作用力來獲得樣品形貌結(jié)構(gòu)信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理成像。自由基攻擊細(xì)胞膜使之結(jié)構(gòu)和 功能喪失，發(fā)生細(xì)胞溶血。這一結(jié)論通過用原子力顯微鏡（AFM)觀察對照組、損傷組和保護(hù) 組紅細(xì)胞形貌得到進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0008] 皮膚老化主要是人的遺傳傾向性（也稱為年代老化）和人對環(huán)境應(yīng)激的生理反應(yīng) (也稱為光老化）的結(jié)果。光老化是外界環(huán)境對皮膚的生物學(xué)應(yīng)答的效果。皮膚對光老化 的應(yīng)答通常與正常的水合作用的缺乏、皮膚下垂以及線條和皺紋外觀有關(guān)。UVB照射可使 成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS)堆積，超過了其清除能力，打破氧化 與抗氧化平衡，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)一系列程序化的細(xì)胞反應(yīng)，甚至調(diào)控衰老相關(guān)的信 號通路，促進(jìn)細(xì)胞衰老的發(fā)生。有研究表明ROS在細(xì)胞內(nèi)的堆積是皮膚光老化發(fā)生發(fā)展過 程中的重要環(huán)節(jié)。人皮膚成纖維細(xì)胞是人皮膚產(chǎn)膠原蛋白的主要場所，其數(shù)量的多少和細(xì) 胞膠原蛋白的產(chǎn)率與皮膚衰老狀態(tài)息息相關(guān)。因此，人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白的產(chǎn)率是 被廣泛應(yīng)用認(rèn)可的一種評價(jià)皮膚衰老狀態(tài)的指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供了一種具有體外抗氧化活性、保護(hù)紅細(xì)胞溶血以及促進(jìn)人皮 膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白產(chǎn)生的合成十五肽，可應(yīng)用于生物制藥與化妝品等領(lǐng)域。
[0010] 本發(fā)明以ABTS自由基、DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、FRAP實(shí)驗(yàn)、APPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶 血實(shí)驗(yàn)以及紫外損傷人皮膚成纖維細(xì)胞來評價(jià)多肽的抗氧化及抗皮膚衰老活性。
[0011] 本發(fā)明所述的合成十五肽縮寫為WVAGLGYFTKNGGPK，分子量1594. 6,序列為：作?-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Lys〇 其中， Trp表示英文名稱為Tryptophan，中文名稱為色氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Val表示英文名稱為Valine，中文名稱為纈氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Ala表示英文名稱為Alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Gly表示英文名稱為Glycine，中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Leu表示英文名稱為Leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Tyr表示英文名稱為Tyrosine，中文名稱為酪氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Thr表示英文名稱為Threonine，中文名稱為蘇氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Lys表示英文名稱為lysine，中文名稱為賴氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Asn表示英文名稱為Asparagine，中文名稱為天冬酰胺的相應(yīng)殘基； Pro表示英文名稱為proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。
[0012] 本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標(biāo)多肽的C-端羧基以共價(jià)鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這 個氨基酸的氨基作為起點(diǎn)，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過程，即 可以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護(hù)基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn) 物。多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0013] 本發(fā)明將終濃度為1-100 Pg/mL的合成十五肽與正常人血紅細(xì)胞混勻，孵育，經(jīng) AAPH損傷2 h后，使得細(xì)胞溶血抑制率達(dá)到56. 76%~86.60%。用100噸/mL的合成十五肽 處理后的與僅用AAPH損傷的紅細(xì)胞組相比，其形貌比單純AAPH處理組光滑，有序，呈現(xiàn) 餅狀結(jié)構(gòu)。用5 Pg/mL樣品處理紅細(xì)胞，其SOD活力由2. 5976 mgprot/ml上升到5. 1958 mgprot/mL，結(jié)果表明，合成十五肽處理后紅細(xì)胞的SOD活性相對于有較大提高，能在生物 醫(yī)藥與化妝品等領(lǐng)域中應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明將濃度為1-10 Kg/mL的合成十五肽加入人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育， 經(jīng)中波紫外（UVB)80mJ/cm2損傷后，細(xì)胞存活率變化不大，使得細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白得率提高了 14. 9-30. 65%。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果： 本發(fā)明首次合成了該肽，并且采用了體外化學(xué)抗氧化方法檢測了合成十五肽的抗氧化 活性，所述合成十五肽具有很強(qiáng)的DPPH、ABTS+自由基清除能力，且其供電子能力較強(qiáng)，同 時應(yīng)用于AAPH損傷的正常人紅細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，使得紅細(xì)胞溶血率顯著降低，SOD活性有較 大的提高，同時，合成十五肽能促進(jìn)紫外損傷的人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白的產(chǎn)生。
【附圖說明】
[0016] 圖 1 為合成十五肽Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Lys的ESI-MS圖譜，其中橫坐標(biāo)為m/z (質(zhì)荷比值）、縱坐標(biāo)為Intensity(信號強(qiáng) 度）。
[0017] 圖 2 為合成肽Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-L ys的ABTS自由基清除活性對比圖。
[0018] 圖 3 為合成肽Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-L ys的DPPH自由基清除活性對比圖。
[0019] 圖 4 為合