壓積，用PBS 稀釋成濃度為20% (體積，v/v)的紅細胞懸液。單獨用100 yg/mL的合成十五肽處理紅細 胞，以0.1 mL 20%紅細胞懸液和0.3 mL PBS共同孵育2 h作為空白對照組，確定樣品不 具有溶血性。
[0033] 應(yīng)用實施例1 0.1 mL 20%紅細胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為0 yg/mL的合成十五肽（用PBS取代，即 為模型組）預(yù)處理20 min后，加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光 孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中，用酶標儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反 應(yīng)混合物作為全溶血對照，計算溶血率，結(jié)果見圖5 ;圖5為合成十五肽添加后進行AAPH損 傷的正常人紅細胞溶血抑制率變化曲線。其中橫坐標為Concentration(濃度）、縱坐標為 Hemolysis inhibition(溶血抑制率）。結(jié)果表明，樣品組相對于模型組，溶血抑制率顯著 升高，并呈現(xiàn)濃度依賴型。
[0034] 同時，將各處理組細胞用離心機于1500 g離心12 min，收集細胞沉淀，用PBS洗3 次離心，棄去上清液，再次重懸。制片時，取10 y L紅細胞重懸液均勻涂于潔凈的云母片上 (要求細胞無重疊、不團聚)，然后用2. 5% (體積，v/v)的戊二醛固定細胞，5 min后，用超純 水沖洗硅片3次，自然風(fēng)干硅片，最后置于原子力顯微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細胞形 貌，用NanoScope軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖6。
[0035] 應(yīng)用實施例2 0.1 mL 20%紅細胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為I yg/mL的合成十五肽預(yù)處理20 min后， 加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物 溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中， 用酶標儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對照，計 算溶血率，結(jié)果見圖5。
[0036] 應(yīng)用實施例3 0.1 mL 20%紅細胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為5 yg/mL的合成十五肽預(yù)處理20 min后， 加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物 溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中， 用酶標儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對照，計 算溶血率，結(jié)果見圖5。
[0037] 應(yīng)用實施例4 0.1 mL 20%紅細胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為100 y g/mL的合成十五肽預(yù)處理20 min 后，加入0.2 mL終濃度為100 mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反 應(yīng)物溶液50 yL用PBS緩沖液稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔 板中，用酶標儀在540 nm處測其吸光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對 照，計算溶血率，結(jié)果見圖5 ;同時，將各處理組細胞用離心機于1500 g離心12 min，收集細 胞沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上清液，再次重懸。制片時，取10 y L紅細胞重懸液均勻 涂于潔凈的云母片上(要求細胞無重疊、不團聚)，然后用2. 5%的戊二醛固定細胞，5 min后， 用超純水沖洗硅片3次，自然風(fēng)干硅片，最后置于原子力顯微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察 細胞形貌，用NanoScope軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖6。
[0038] 應(yīng)用實施例5 0.1 mL 20%紅細胞懸液經(jīng)0.1 mL濃度為0 yg/mL (用PBS取代，即為正常對照組） 的合成十五肽預(yù)處理20 min后，加入0.2 mL終濃度為0 mM的AAPH溶液(用PBS取 代，即為正常對照)，微震、避光孵育2 h，取各處理組的反應(yīng)物溶液50 yL用PBS緩沖液 稀釋至I mL，1500 g離心12 min，取上清液于96孔板中，用酶標儀在540 nm處測其吸 光度，同樣地，用蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物作為全溶血對照，計算溶血率，結(jié)果見圖5。同時，將 各處理組細胞用離心機于1500 g離心12 min，收集細胞沉淀，用PBS洗3次離心，棄去上 清液，再次重懸。制片時，取10 y L紅細胞重懸液均勻涂于潔凈的云母片上(要求細胞無重 疊、不團聚)，然后用2. 5%的戊二醛固定細胞，5 min后，用超純水沖洗硅片3次，自然風(fēng)干硅 片，最后置于原子力顯微鏡上，在輕敲模式下掃描觀察細胞形貌，用NanoScope軟件分析實 驗數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖6。
[0039] 圖6為不同處理組紅細胞的原子力顯微鏡（AFM)成像圖。其中a為正常紅細胞， b為100 mM的AAPH處理2 h的紅細胞，c為用100 Mg/mL的合成肽Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Lys 預(yù)處理 20 min 之后再加 100 mM AAPH 培養(yǎng)2 h的紅細胞。
[0040] 結(jié)果表明，正常紅細胞具有典型的雙凹面結(jié)構(gòu)，細胞表面光滑，四周高度基本一 致。AAPH處理組細胞表面變得粗糙，細胞嚴重塌陷，高度有所降低，形狀不規(guī)則。合成十五 肽預(yù)處理的保護組，細胞損傷程度明顯減弱，呈現(xiàn)表面光滑的不規(guī)則餅狀結(jié)構(gòu)。
[0041]表 2
應(yīng)用實施例6 0.1mL20%紅細胞懸液經(jīng)0.1mL濃度為5 yg/mL(用PBS取代，即為正常對照組） 的合成十五肽預(yù)處理20 min后，加入0.2 mL終濃度為0 mM的AAPH溶液(用PBS取 代，即為正常對照)，微震、避光孵育2 h，將各處理組細胞用離心機于1500 g離心12 min， 收集細胞沉淀，用PBS洗3次離心，加入4°C預(yù)冷的超純水，150r/min震蕩lOmin，1000 Og離 心30min，收集上清液備用，按照試劑盒(南京建成）的說明書進行測定其中的SOD活性，結(jié) 果見表2。
【主權(quán)項】
1. 一種十五肽，其特征是該合成十五肽的氨基酸序列為Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-T yr-Phe_Thr_Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Lys〇2. 權(quán)利要求1所述一種十五肽的應(yīng)用，其特征在于將所述十五肽與紅細胞混合，在 AAPH的作用下，孵育2h后，使得細胞溶血抑制率達到56. 76%~86. 60%，其形貌比單純AAPH 處理組光滑，有序，呈現(xiàn)餅狀結(jié)構(gòu)；所述十五肽的濃度為1-100 呢/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述十五肽能使細胞溶血抑制率高達 86. 60 ±0. 83%。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述十五肽的濃度為5呢/mL，所述十五 肽能使細胞SOD活性由 2. 5976mgprot/mL上升到 5. 1958mgprot/mL。5. 權(quán)利要求1所述一種十五肽的應(yīng)用，其特征在于，在UVB的作用下，將所述十五肽 與人皮膚成纖維混合，孵育72h后，但是，膠原蛋白得率提高了 14. 9-30. 65%，所述十五肽 的濃度為1-10Kg/mL。6. 權(quán)利要求1所述的一種十五肽在制備生物醫(yī)藥或化妝品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種十五肽及其應(yīng)用，所述合成十五肽的氨基酸序列如下所示：Trp-Val-Ala-Gly-Leu-Gly-Tyr-Phe-Thr-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Lys，縮寫為WVAGLGYFTKNGGPK，分子量1594.6，純度95%以上。本發(fā)明的多肽使用多肽合成儀，采用固相合成法合成。本發(fā)明的目的是提供了一種具有體外抗氧化活性、保護紅細胞溶血以及促進人皮膚成纖維細胞膠原蛋白產(chǎn)生的合成十五肽，可應(yīng)用于生物制藥與化妝品等領(lǐng)域。
【IPC分類】A61P17/18, C07K7/08, A61Q19/08, A61K8/64, A61P39/06, A61P17/16, A61K38/10
【公開號】CN105175507
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】張學(xué)武, 曾巧輝
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月28日