一株球形賴氨酸芽胞桿菌及其晶體蛋白和活性產物的應用
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株球形賴氨酸芽胞桿菌及其晶體蛋白和活性產物的分離方法與應用，尤其是涉及一株高效抗腫瘤野生型菌株(Lysinibacillus sphaericus BsX050)及其活性代謝產物的分離方法與抗腫瘤方面的應用，及其晶體蛋白抗腫瘤方面的應用。
【背景技術】
[0002]近年來，芽胞桿菌{Bacillus)作為一類可產生豐富代謝產物的微生物類群，日趨受到重視。芽胞桿菌大多能分泌高活性的胞外產物，如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、纖維素酶等酶類。芽胞桿菌被作為益生菌廣泛應用于害蟲防治、部分病原菌的抑制和抗腫瘤活性研究。
[0003]隨著人類疾病譜的變化，惡性腫瘤也已成為人類前三位的死亡原因之一，嚴重危害人類健康。抗腫瘤治療日益彰顯其重要性。新的治療手段及療效特異性是當前醫(yī)學界研究的熱點。芽胞桿菌是一種昆蟲病原細菌。近年，有研究發(fā)現某些非殺蟲活性的芽胞桿菌能夠產生抗癌細胞活性的代謝物，對人類某些癌細胞具有細胞毒性?，F對這類芽胞桿菌的抗腫瘤研究進展綜述如下。
[0004]蘇云金芽胞桿菌:日本學者Mizuki等于1999年首次發(fā)現了對磷翅目和雙翅目無殺蟲活性，但對體外培養(yǎng)的人類白血病T細胞(M0LT-4)和人類宮頸癌傳代細胞(Hela)有殺傷力的Bt菌株。2000年，Mizuki等對分離到的蛋白進行理化性質分析，發(fā)現該類伴胞蛋白序列包含了 Bt伴胞晶體蛋白共有的5個保守區(qū)域，但與現有的其他Cry和Cyt蛋白同源性很低(< 25%)，只有在胰蛋白酶和蛋白酶K的作用下，降解為活性片段，此蛋白才會選擇性地毒殺人類白血病T細胞M0LT-4和人類宮頸癌傳代細胞HeLa，而對正常細胞無作用，該伴胞素首次被命名為parasporin( PS)。截止目前為止，分離得到的PS蛋白主要劃分為6群18類。PSl類包括11個抗癌晶體蛋白，最早發(fā)現的PSlAal也稱Cry31Aal，原毒素分子量為81kDa，具有Cry蛋白類似典型的結構域，PSlAa的蛋白經胰酶酶解后產生15和56kDa的活性多肽，可能通過形成多肽二聚體而對Hela，HL-60，M0LT-4，HepG2等細胞具有殺傷力；PS2類包括3個抗癌晶體蛋白，PS2Aal也稱Cry46Aal，分子量為37kDa，不具有Cry蛋白類似典型的結構域，Cryl5Aa與球形芽胞桿菌的Mtx2和Mtx3有很高的同源性，PS2的活性部分經X-衍射分析發(fā)現該蛋白有很多的β -片層結構圍繞一個長軸卷曲而成，PS2Aa原毒素經蛋白酶K酶解后產生30kDa的活性多肽，對MOLT-4，HL-60，!fepG2等細胞具有殺傷力；PS3類包括2個抗癌晶體蛋白，PS3Aal也稱Cry41Aal，分子量為93kDa，具有Cry蛋白類似典型的3個結構域和5個保守區(qū)，PS3Aa蛋白經蛋白酶K在N端和C端酶解后，形成64kDa的活性多肽，對HL-60和!fepG2具有中等毒力；PS4，PS5，PS6類各包含I個抗癌晶體蛋白；PS4Aal也稱Cry45Aal，分子量為31kDa，無Cry蛋白類似典型的3個結構域和5個保守區(qū)，于其他晶體蛋白的同源性較低，PS4Aal蛋白經蛋白酶K在C端酶解后產生27kDa的活性多肽，對Sawano，HL-60, MOLT-4，TCS, Caco-2細胞具有較高的細胞毒力。PS5Aal分子量為34kDa，PS6Aal分子量為84kDa，具有典型的3個結構域，PS6Aa經胰蛋白酶在N端消化后產生73kDa的活性多肽，對HepG2和Hela細胞具有較高的毒性。
[0005]解淀粉芽胞桿菌:2011年華中農業(yè)大學微生物實驗室發(fā)現一株對腫瘤有殺傷力的解淀粉芽胞桿菌，通過對發(fā)酵上清液的分離得到脂肽類表面活性劑，經研究發(fā)現，當脂肽的濃度大于50 μ g/mL時，脂肽類表面活性劑有明顯的體外抑制腫瘤細胞活性。
[0006]枯草芽胞桿菌:2013年中國藥科大學郭傳龍等從枯草芽胞桿菌的發(fā)酵液中分離到了一種環(huán)脂肽(CLPs )，該CLPs對MCF-7有明顯的細胞毒性，而對正常HELF細胞無細胞毒性，研究發(fā)現環(huán)脂肽能夠與體外培養(yǎng)癌細胞的胞膜結合，形成離子通道，出現孔洞，導致胞內容物外泄，細胞DNA斷裂。Hwang MH等發(fā)現環(huán)脂肽可以從體液免疫方面來抵抗腫瘤入侵。
[0007]蠟樣芽胞桿菌:2008年中國農業(yè)大學食品科學與工程學院教育部功能乳品重點實驗室發(fā)現蠟樣芽胞桿菌ZH-14產生的胞外蛋白對腫瘤細胞S-180的抑制率在43.6%以上。
[0008]海帶內生芽胞桿菌:2015年大連海洋大學食品科學與工程學院發(fā)現海帶內生芽胞桿菌DNN7和HSN2胞外蛋白具有抗腫瘤活性，DNN7胞外蛋白對體外慢性粒細胞癌細胞K562，肝腫瘤細胞H印G2和乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制率分別為96.46%，42.99%和85.7% ；HSN2胞外蛋白對體外慢性粒細胞癌細胞K562，肝腫瘤細胞H印G2和乳腺癌細胞MDA-MB-231 的抑制率分別為 92.65%，66.8%, 88.48%。
[0009]球形芽胞桿菌:2014年Luo W在球形芽胞桿菌1Κ?8? 2 {Lys ini bacillussphaericus IAB872)中發(fā)現一種Bin蛋白，這種蛋白能夠抑制一系列人類腫瘤細胞在體外的增殖。Bin蛋白的抗增殖作用與細胞凋亡關聯，導致細胞內Bax/Bcl-2的比率增加，上調CyclinBl蛋白和下調CDC25C蛋白的表達，并且其抗增殖作用在G2/Ms時期與細胞周期阻滯相關聯。Bin蛋白能促進細胞凋亡，抑制運動和侵襲肺癌細胞(A549)。該報道提到球形芽胞桿菌IAB872提取的可溶性晶體毒素對肺癌細胞(A549)和肝癌細胞(HepG2)具有抗腫瘤活性，而未提到其對小鼠乳腺癌細胞(4T1)和肝癌細胞(Hep-3B)有效果，盡管報道提及晶體毒素的可溶性，但未說明其具體形態(tài)特征。
[0010]雖然有關芽胞桿菌代謝產物和晶體蛋白抗腫瘤的研究起始較早，但對于球形芽胞桿菌代謝產物及晶體蛋白抗腫瘤的研究極少。球形芽胞桿菌是一種在自然界中廣泛分布、形成亞末端膨大胞子囊和球形芽胞的好氣芽胞桿菌，其滅蚊選擇性強，對非靶標生物和人畜無毒性，在自然界中易降解不污染環(huán)境，其毒殺作用主要是由其產生的毒素蛋白(晶體蛋白和Mtx蛋白)實現的。人們對該類細菌的研究主要集中于殺蟲方面，而在抗腫瘤方面的研究極少，且報道只說明球形芽胞桿菌IAB872提取的可溶性晶體毒素對A549癌細胞具有抗腫瘤活性，而未提其發(fā)酵液中的活性代謝產物具有抗腫瘤廣譜活性，同時也未提及晶體毒素的具體形態(tài)特征。
[0011]其他:金永生等在多粘芽胞桿菌HY96-2發(fā)酵液乙酸乙酯部分分離得到金雀異黃素，發(fā)現它具有抗腫瘤的作用。李偉利用海蝦毒性法測定分離自海膽的多粘芽胞桿菌的抗腫瘤活性，結果表明發(fā)酵液中蛋白有一定的抗腫瘤作用。

【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，提供一株球形賴氨酸芽胞桿菌及其晶體蛋白和活性產物的應用。
[0013]本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案是，
一株球形賴氨酸芽胞桿菌菌株Lysinibacillus sphaericus BsX050，它的活性產物對腫瘤細胞具有較好的抑制作用，并對其抗腫瘤活性物進行了初步分離，同時它產生的晶體蛋白也具有抗腫瘤活性。
[0014]本發(fā)明之球形賴氨酸芽胞桿菌，為球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050，Lysinibacillussphaericus BsX050，于2014年4月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址:中國武漢武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO:M 2014160。
[0015]本發(fā)明之球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050的分離:采用溫度篩選法，從長沙岳麓山采集的土樣中直接分離得到一株具有球形芽胞桿菌性狀的細菌，經菌落形態(tài)觀察、革蘭染色、相差顯微鏡及掃描電鏡觀察。
[0016]該菌株的具體分離過程:從長沙