岳麓山采集土樣，加入無菌水，混勻，75_80°C加熱30min，取適量勻漿涂布于LB平板上，30°C條件下培養(yǎng)48 h，從平板上挑取單菌落再次稀釋劃線于LB平板上，30°C條件下培養(yǎng)24-48 h，將重復分離純化到的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，30°C，120-160 rpm，培養(yǎng)12 h，50%甘油混勻，_80°C冰箱中長期保藏。
[0017]革蘭染色過程:取菌液少許，涂片并固定；結(jié)晶紫染色1-2 min，水洗并用吸水紙吸干；碘液媒染1-2 min，水洗并吸干；用體積濃度95%酒精脫色，直到酒精不出現(xiàn)紫色時即停止(大約0.5 min)，立即水洗，并吸干；番紅復染3-4 min，水洗并吸干；在光學顯微鏡油鏡下觀察菌體形狀與顏色。
[0018]掃描電鏡觀察:
取菌液lmL，9000-11000 rpm, 3 min，離心，去上清，PBS緩沖液洗滌十次，最后用200微升PBS緩沖液重懸菌體，加入等量戊二醛固定，在掃描電子顯微鏡下觀察單個菌體。
[0019]晶體蛋白的特征研究。Lysinibacillus sphaericus BsX050在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)60-72 h后，離心，去上清，先用0.5mol/LNaCl溶液洗滌菌體，再用質(zhì)量濃度0.9%的NaCl洗滌菌體，超聲破碎，沉淀并分別用5%丙酮和水洗滌，用收集的晶體蛋白制備電鏡樣品進行掃描電鏡及超薄切片觀察。晶體蛋白的抗腫瘤活性。收集的晶體蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后進行腫瘤細胞毒性實驗。所述球形賴氨酸芽胞桿菌的晶體蛋白具有抗腫瘤的作用。
[0020]所述球形賴氨酸芽胞桿菌活性代謝產(chǎn)物的分離方法，包括以下步驟:
方法一:從LB平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到含有LB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，30°C，120-160rpm，振蕩培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C，120_160rpm，20%-40%的相對濕度，振蕩培養(yǎng)48-72 h后，8000 — IlOOOrpm離心15min ;收集發(fā)酵上清液，加入硫酸銨，使發(fā)酵液中硫酸銨的質(zhì)量百分比為30%-80%，于4°C沉淀過夜，8000 —IlOOOrpm離心20min，收集沉淀，用水溶解，得到粗提蛋白，過0.22 μ m濾膜，在蛋白質(zhì)純化儀(AKTA)上進行初步分離，收集具有生物活性的組分即得。
[0021]或者采用方法二:從LB平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到含有LB液體培養(yǎng)基的搖瓶中，30°C，120-160rpm，振蕩培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 °C，120-160rpm，20%-40% 的相對濕度，振蕩培養(yǎng) 48 -72 h 后，8000 — IlOOOrpm 離心 15min ;收集發(fā)酵上清液，加入硫酸銨，使發(fā)酵液中硫酸銨的質(zhì)量百分比為30%-80%，于4°C沉淀過夜，8000 -1lOOOrpm離心20min，收集沉淀，用水溶解，加鹽酸調(diào)pH值至2.0，4°C放置過夜，8000 -1lOOOrpm離心1min收集沉淀，用三氯甲烷和甲醇(v/v=2:1)溶解沉淀，8000 —IlOOOrpm離心lOmin，取上清冷凍干燥，用甲醇溶解，過0.22微米濾膜，利用高效液相色譜儀進一步分離純化，得到活性代謝產(chǎn)物。
[0022]進一步，方法一中，初步分離時，蛋白質(zhì)純化儀(AKTA)上所用凝膠柱為Superdex200。進一步純化使用強陰離子交換柱。
[0023]進一步，方法二中，分離純化時，所述高效液相色譜儀中用C18反相色譜柱。
[0024]將所得球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050活性代謝產(chǎn)物進行腫瘤細胞毒性實驗，其具有抗腫瘤活性。
[0025]本發(fā)明之球形賴氨酸芽胞桿菌對4T1細胞和H印-3B細胞具有明顯的毒性，同時其活性代謝產(chǎn)物具有廣譜的抗腫瘤活性。
[0026]本發(fā)明其包含了晶體蛋白毒素的具體形態(tài)特征，同時對4T1細胞和H印-3B細胞具有細胞毒性，而對正常細胞HUVEC無明顯毒性。
[0027]微生物保藏情況說明
本發(fā)明之球形賴氨酸芽胞桿菌，為球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050，Lysinibacillussphaericus BsX050，于2014年4月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址:中國武漢武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO:M 2014160。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株的形態(tài)特征圖；a為革蘭染色圖(2000X ) ;b為相差顯微鏡鏡檢圖(1000X ) ;c為掃描電子顯微鏡鏡檢圖；
圖2為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株發(fā)酵上清液粗提物的抗腫瘤譜測定圖；
圖3 — a為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株發(fā)酵上清液中抗腫瘤活性物的陰離子交換柱分離圖；
圖3 — b為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株發(fā)酵上清液中抗腫瘤活性物陰離子交換分離后收集各峰的B16細胞毒性檢測；
圖3 — c為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株發(fā)酵上清液中抗腫瘤活性物的高效液相色譜分離圖；
圖3 — d為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株發(fā)酵上清液中抗腫瘤活性物高效液相色譜分離后收集各峰的B16細胞毒性檢測；
圖4 一 a為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株晶體蛋白的SDS-PAGE鑒定圖；
圖4 一 b為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株晶體蛋白的質(zhì)譜鑒定分析表;
圖5為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株晶體蛋白掃描電鏡及超薄切片觀察圖；a為掃描電鏡圖；b為超薄切片圖；
圖6 — a為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株晶體蛋白處理24h的抗腫瘤活性檢測圖；圖示從左到右依次為11爪^(:、41'1、!1印-38細胞；
圖6 — b為本發(fā)明實施例球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株晶體蛋白處理48h的抗腫瘤活性檢測圖；圖示從左到右依次為4T1、H印-3B、HUVEC細胞； 圖7為本發(fā)明實施例掃描電鏡觀察球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株晶體蛋白作用腫瘤細胞24h后，細胞的變化圖；
圖8為本發(fā)明實施例激光共聚焦顯微鏡檢測球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050菌株晶體蛋白作用腫瘤細胞24h后，細胞內(nèi)部的變化圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0030]實施例1
本發(fā)明之球形賴氨酸芽胞桿菌，為球形賴氨酸芽胞桿菌BsX050，Lysinibacillussphaericus BsX050，于2014年4月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址:中國武漢武漢大學)，保藏編號為CCTCC NO:M 2014160。
[0031](一)該菌株的具體分離過程:從長沙岳麓山采集土樣，加入無菌水，混勻，75°C加熱30min，取適量勻漿涂布于LB平板上，30°C條件下培養(yǎng)48 h，從平板上挑取單菌落再次稀釋劃線于LB平板上，30°C條件下培養(yǎng)24h，將重復分離純化到的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，30°C，120rpm，培養(yǎng)12 h，50%甘油混勻，_80°C冰箱中長期保藏。
[0032]革蘭染色過程:取菌液少許，涂片并固定；結(jié)晶紫染色2 min，水洗并用吸水紙吸干；碘液媒染2 min，水洗并吸干；用體積濃度95%酒精脫色，直到酒精不出現(xiàn)紫色時即停止(大約0.5 min)，立即水洗，并吸干；番紅復染4 min，水洗并吸干；在光學顯微鏡油鏡下觀察菌體形狀與顏色。
[0033]掃描電鏡觀察:
取菌液lmL，11000 rpm, 3 min，離心，去上清，PBS緩沖液洗滌十次，最后用200微升(μυ PBS緩沖液重懸菌體，加入等量戊二醛固定，在掃描電子顯微鏡下觀察單個菌體。
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