一種gii.17型諾如病毒基因組擴(kuò)增引物和擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增引物和 擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 諾如病毒（Norovirus)是全球散發(fā)性與流行性胃腸炎的重要食源性病原之一。 NoV的危害主要在于其極強(qiáng)的傳播能力，美國疾病控制中心已于2006年將其列為生物恐怖 B類因子。該病毒可感染各年齡段人群，主要臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、發(fā)熱等，對(duì)兒童、老人 及免疫缺陷人群還易造成脫水性死亡。據(jù)報(bào)道，諾如病毒每年至少造成2. 3億人次的感染， 在發(fā)展中國家更是導(dǎo)致20萬例以上5歲以下兒童的死亡，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成了極大的威 脅。至目前為止，還沒有有效的抗病毒藥物及治療手段。
[0003] 作為RNA病毒，諾如病毒具有豐富的遺傳多樣性，根據(jù)其衣殼蛋白序列同源性可 將病毒分成GI-GVI的6個(gè)基因組（Genogroup)，而GI、GII和GIV可感染人類。每個(gè)基因 組又可進(jìn)一步分成不同的基因型（Genotype)，例如GI含有9個(gè)基因型，GII含有23個(gè)（并 不斷增加）。其中，GII. 4型被報(bào)道是全球近二十年來的主要流行基因型，約80%的諾如病 毒感染是由這種型別的毒株引起的，并且該病毒每隔兩三年就會(huì)產(chǎn)生一種新的變異株，同 時(shí)造成一輪大范圍的病毒流行。然而引起注意的是，2014年底在中國、日本、韓國等地暴發(fā) 了多起由一種新型GII. 17諾如病毒流行株引起的胃腸炎疫情，同時(shí)散發(fā)性病例中也證實(shí) 了該型別毒株的廣泛存在。有學(xué)者提出了疑問，是否這種新型別毒株將替代已流行近二十 年的GII. 4型呢？因此，充分積累GII. 17型毒株的基因組信息，掌握其自身變異特點(diǎn)以及 與原流行株GII. 4的差異，將對(duì)這種新流行株的預(yù)防與控制具有重要意義。
[0004] 諾如病毒基因組長約7. 5-7. 8kb，包括3個(gè)開放閱讀框。目前報(bào)道的基因組擴(kuò)增 方法有直接擴(kuò)增法以及分段擴(kuò)增法，其中我們前期工作中針對(duì)GII. 4型諾如病毒建立的 "4+1+1"擴(kuò)增策略具有操作簡單、周期短、成本低以及靈敏度高的特點(diǎn)。而對(duì)于新流行基因 型GII. 17,目前還未有關(guān)于其擴(kuò)增方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏度的GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增引物和擴(kuò)增 方法。
[0006] 本發(fā)明的GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增引物，其特征在于，包括七對(duì)擴(kuò)增引物：
[0007] 引物對(duì) I :II-P1F :5' -GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3' ；
[0008] II. 17-1R :5'-GCAACTTTCTTGGCTAGCTC-3' ；
[0009] 引物對(duì) 2 :ΙΙ· 17-2F :5, -CATACATGAGGACTCTTGAC-3' ；
[0010] II. 17-2R :5'-CTTAGCAATGGCAAGCTC-3' ；
[0011] 引物對(duì) 3 :ΙΙ· 17-3F :5' -CAGGGATGAAGATGACCTCAC-3' ；
[0012] II. 17-3R :5'-GAGACCACCAAATGCTCTG-3' ；
[0013] 引物對(duì) 4 :ΙΙ· 17-4F :5' -CCTCGACAAGACAACCTCC-3' ；
[0014] G2SKR :5'-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3' ；
[0015] 引物對(duì) 5 :NV2of2 :5' -GGAGGGCGATCGCAATC-3' ；
[0016] GV132 :5'-CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3' ；
[0017] 引物對(duì) 6 :ΙΙ· 17-6F :5' -GCTCACTCTGGAGACTATC-3' ；
[0018] II. 17-6R :5,-TCACTAAACACGTGACTCC-3，；
[0019] 引物對(duì) 7 :ΙΙ· 17-SeqlR :5, -ACTTCTCTCTGGCTAAGTGG-3' ；
[0020] II. 17-Seq6F :5, -CAACCAAGCAGCTGCAATC-3' ；
[0021] R 代表 A/G，H 代表 A/C/T，N 代表堿基 A/C/T/G。
[0022] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種GII. 17型諾如病毒基因組的擴(kuò)增方法，其特征 在于，分別以上述引物對(duì) Π -PIF/II. 17-1R、II. 17-2F/II. 17-2R、II. 17-3F/II. 17-3R、 II. 17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132、II. 17-6F/II. 17-6R 和 II. 17-SeqlR/II. 17-Seq6F 作為擴(kuò) 增引物的上下游引物，以GII. 17型諾如病毒的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增 產(chǎn)物，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定，再拼接比對(duì)，得到GII. 17型諾如病毒基因組全 長序列。
[0023] 優(yōu)選，所述的RT-PCR，其反應(yīng)體系為：含有2 X one-stepRT-PCR mixture 10 μ L， 10 μ mol/L上游引物和10 μ mol/L下游引物各0. 6 μ L，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液 0· 8 μ L，RNA模板2 μ L，其余由雙蒸水補(bǔ)足至20 μ L ;反應(yīng)條件為：50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C 預(yù)變性3min，然后94°C 30s、55°C 30s、72°C 80s，共30次循環(huán)后，72°C最后延伸7min。
[0024] 本發(fā)明針對(duì)我國2014/2015年冬季新出現(xiàn)的GII. 17型諾如病毒流行基因型，根據(jù) 基因組所包含的三個(gè)開放閱讀框設(shè)計(jì)了 "4+1+1"的分段擴(kuò)增策略，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng) 的擴(kuò)增引物，將該擴(kuò)增引物應(yīng)用于實(shí)際檢出樣本，獲得了 GII. 17型諾如病毒基因組序列。 利用該擴(kuò)增引物擴(kuò)增GII. 17型諾如病毒基因組序列的方法具有操作簡單、周期短、成本低 以及靈敏度高的特點(diǎn)。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、檢驗(yàn)檢疫等具有諾如病毒檢測(cè)需求 及相應(yīng)的科研領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0025] 圖1是GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增策略及相應(yīng)引物的設(shè)計(jì)位置。
[0026] 圖2是適用于GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增用引物的RT-PCR靈敏度分析。電泳 順序?yàn)?M，1-42 ;其中 M 為 DNA Ladder，1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42 分別為 基因組擴(kuò)增引物 Π -PIF/II. 17-1R、II. 17-2F/II. 17-2R、II. 17-3F/II. 17-3R、II. 17-4F/ G2SKR、NV2of2/GV132、II. 17-6F/II. 17-6R 和檢測(cè)引物 G2SKF/G2SKR 在病毒 RNA 不同稀釋 度（依次為IO1 - IO6倍稀釋）下擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0027] 圖3是實(shí)際樣本中病毒基因組的擴(kuò)增效果。電泳順序?yàn)镸，1-18 ;其中M為DNA Ladder，l-6、7-12、13-18依次為實(shí)際樣本L324、L337、L343進(jìn)行"4+1+1"策略擴(kuò)增基因組 6個(gè)產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0029] 實(shí)施例1 :GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增策略及相應(yīng)引物的設(shè)計(jì)
[0030] (I)GII型諾如病毒基因組約7. 5kb，包括三個(gè)0RF，其中ORFl長約5. lkb，0RF2長 約I. 6kb，0RF3長約0. 8kb。以一代桑格脫氧核苷酸測(cè)序法為基礎(chǔ)，則每個(gè)擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)為 I. 3kb-l. 6kb，其中ORFl分為4個(gè)片段，0RF2和0RF3均為1個(gè)片段。此外，為獲得基因組 5'和3'端完整序列，分別在基因組兩端設(shè)計(jì)擴(kuò)增長度在IOO-SOObp的片段，相應(yīng)引物分別 命名為II. 17-SeqlR和II. 17_Seq6F。具體基因組分段策略及相應(yīng)引物位置可見圖1。
[0031] (2)在建立擴(kuò)增策略的基礎(chǔ)上，根據(jù)Oligo軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，具體引物信息見 表1。其中，引物核苷酸序列中的R代表A/G，H代表A/C/T，N代表堿基A/C/T/G。
[0032] 表1 GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增用引物信息
[0035] 3位置參考 GII. 17 的代表序列-KP998539-HK-2014。
[0036] 實(shí)施例2 :適用于GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增用引物的RT-PCR靈敏度分析
[0037] (1)病毒樣本處理及核酸提?。和ㄟ^PBS溶液（ρΗ7· 4, DEPC處理）稀釋收集的待 處理樣品（含有GII. 17型諾如病毒L324)至10% (w/v)濃度，充分振蕩混勻，于12000Xg 下離心10min收集上清液140 μ L，并通過RNA提取試劑盒抽提樣本中病毒RNA共60 μ L，并 進(jìn)行IOX梯度的適當(dāng)稀釋處理。
[0038] (2)"4+1+1"基因組分段擴(kuò)增法（即分6段擴(kuò)增，所使用的引物配組如下=II-PlF/ II. 17-1R、II.17-2F/II. 17-2R、II.17-3F/II. 17-3R、II. 17-4F