/G2SKR、NV2of2/GV132 和 II. 17-6F/II. 17-6R，每次RT-PCR反應(yīng)選擇一對(duì)引物）：采用20yL的一步法RT-PCR反 應(yīng)體系，含有2Xone-stepRT-PCR mixture 10yL，上游引物和下游引物（lOymol/L)各 0· 6 μ L，MLV/RNasin/HS-Taq 酶混合液 0· 8 μ L，樣本 RNA 模版 2 μ L，其余由 CldH2O 補(bǔ)足。
[0039] 反應(yīng)條件為：50°C 反轉(zhuǎn)錄 30min，94°C 預(yù)變性 3min，然后 94°C 30s、55°C 30s、 72°C 80s，共30次循環(huán)后，72°C最后延伸7min。
[0040] 以檢測(cè)引物 G2SKF/G2SKR(G2SKR :5,-CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3，；G2SKF : 5' -CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3'）作為對(duì)照，按照上述體系和反應(yīng)條件進(jìn)行。
[0041] (3)電泳、PCR產(chǎn)物序列測(cè)定：取擴(kuò)增產(chǎn)物5yL，1.0 %的瓊脂糖凝膠（含 0.05%。6〇1(1 View核酸染料）進(jìn)行電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。按引物對(duì) II-P1F/II. 17-1R、II. 17-2F/II. 17-2R、II.17-3F/II. 17-3R、II.17-4F/G2SKR、NV2of2/ GV132和II. 17-6F/II. 17-6R的順序，諾如病毒基因組擴(kuò)增條帶依次為1551bp、1511bp、 1597bp、1483bp、1680bp、908bp。電泳結(jié)果如圖2,基因組擴(kuò)增引物能檢出的樣本最低稀 釋度與常用檢測(cè)引物 G2SKF/G2SKR(G2SKR :5' -CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-3' ；G2SKF : 5' -CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3'）一致，均為IO3倍稀釋，這表明新設(shè)計(jì)引物可達(dá)到檢測(cè)引物的 靈敏度。
[0042] 實(shí)施例3 :實(shí)際樣本中病毒基因組的擴(kuò)增效果
[0043] (1)病毒樣本處理及核酸提?。喝II. 17型諾如病毒陽性樣本L324、L337、L343， 通過PBS溶液（pH7. 4, DEPC處理）稀釋待處理樣品至10% (w/v)濃度，充分振蕩混勻，于 12000 X g下離心10min收集上清液140 μ L，并通過RNA提取試劑盒抽提樣本中病毒RNA共 60 μ L0
[0044] (2) "4+1+1"因組分段擴(kuò)增法（即分6段擴(kuò)增，所使用的引物配組如下：II-P1F/ 11.17- 1R、II.17-2F/II. 17-2R、II.17-3F/II. 17-3R、II. 17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 II. 17-6F/II. 17-6R，另外添加 II. 17-seqlR/II. 17_seq6F-對(duì)引物，用于擴(kuò)增補(bǔ)充完整基 因組的5'與3'端序列，每次RT-PCR反應(yīng)選擇一對(duì)引物）：采用20 μ L的一步法RT-PCR反 應(yīng)體系，含有2Xone-stepRT-PCR mixture 10yL，上游引物和下游引物（lOymol/L)各 0· 6 μ L，MLV/RNasin/HS-Taq 酶混合液 0· 8 μ L，樣本 RNA 模版 2 μ L，其余由 CldH2O 補(bǔ)足。
[0045] 反應(yīng)條件為：50°C 反轉(zhuǎn)錄 30min，94°C 預(yù)變性 3min，然后 94°C 30s、55°C 30s、 72°C 80s，共30次循環(huán)后，72°C最后延伸7min。
[0046] (3)電泳、PCR產(chǎn)物序列測(cè)定：取擴(kuò)增產(chǎn)物5yL，1.0 %的瓊脂糖凝膠（含 0.05%〇G〇ld View核酸染料）進(jìn)行電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。按引物對(duì)II-PlF/ 11.17- 1R、II.17-2F/II. 17-2R、II.17-3F/II. 17-3R、II. 17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132 和 II. 17-6F/II. 17-6R的順序，諾如病毒基因組擴(kuò)增條帶依次為1551bp、1511bp、1597bp、 1483bp、1680bp、908bp。電泳結(jié)果如圖3, II. 17-seqlR/II. 17_seq6F的擴(kuò)增產(chǎn)物也被擴(kuò)增 出來，結(jié)果表明，三份樣本均成功獲得擴(kuò)增。
[0047] (4)基因組序列拼接與比對(duì)：對(duì)三份樣本通過引物對(duì)II-P1F/II. 17-1R、 11.17- 2F/II. 17-2R、II.17-3F/II. 17-3R、II. 17-4F/G2SKR、NV2of2/GV132、II.17-6F/ II. 17-6R和II. 17-seqlR/II. 17-seq6F的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并拼接，分別獲得三條基因組序 列；樣本L324基因組長(zhǎng)度為7498bp，其基因組核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；樣本L337 基因組長(zhǎng)度為7495bp，其基因組核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；樣本L343基因組長(zhǎng)度 為7495bp，其基因組核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。將三條基因組序列分別提交進(jìn)行 BLAST分析，結(jié)果表明，GII. 17型諾如病毒L324、L337和L343分別與Genbank登錄號(hào)為： KP"8539. 1 (香港）、LC〇37415· 1 (日本）、KR〇2〇5〇3· 1 (廣州）及 KR〇83〇l7· 1 (美國(guó)）等 GII. 17型諾如病毒毒株基因組序列達(dá)到99%的相似度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種GII. 17型諾如病毒基因組擴(kuò)增引物，其特征在于，包括七對(duì)擴(kuò)增引物： 引物對(duì)I:II-PlF:5' -GTGAATGAAGATGGCGTCTAAC-3' ； ILlT-IRiSr -GCAACTTTCTTGGCTAGCTC-Sr ； 引物對(duì) 2 :II? 17-2F:5' -CATACATGAGGACTCTTGAC-3' ； 11. 17-2R： 5r -CTTAGCAATGGCAAGCTC-3r ； 引物對(duì) 3 :II? 17-3F:5' -CAGGGATGAAGATGACCTCAC-3' ； II? 17-3R:5' -GAGACCACCAAATGCTCTG-3'; 引物對(duì) 4 :II? 17-4F:5' -CCTCGACAAGACAACCTCC-3' ； G2SKR：5, -CcRCCNGCATRHCCRTTRTACAT-Sr； 引物對(duì) 5 :NV2of2 :5，-GGAGGGCGATCGCAATC-3，； GV132:5， -CCRGCRAAGAAAGCTCCAGCCAT-3，； 引物對(duì) 6 :II? 17-6F:5' -GCTCACTCTGGAGACTATC-3'; II? 17-6R:5' -TCACTAAACACGTGACTCC-3'; 引物對(duì) 7 :II. 17-SeqlR:5' -ACTTCTCTCTGGCTAAGTGG-3'; II.n-SeqGFd' -CAACCAAGCAGCTGCAATC-3'; R代表A/G，H代表A/C/T，N代表堿基A/C/T/G。2. -種GII. 17型諾如病毒基因組的擴(kuò)增方法，其特征在于，分別以權(quán)利要求1所述 的引物對(duì)II-P1F/II. 17-1R、II. 17-2F/II. 17-2R、II. 17-3F/II. 17-3R、II. 17-4F/G2SKR、 NV2of2/GV132、II. 17-6F/II. 17-6R和II. 17-SeqlR/II. 17_Seq6F作為擴(kuò)增引物的上下游 引物，以GII. 17型諾如病毒的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定，再拼接比對(duì)，得到GII. 17型諾如病毒基因組全長(zhǎng)序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增方法，其特征在于，所述的RT-PCR，其反應(yīng)體系為：含 有 2X〇ne_stepRT-PCRmixtureIOyL，IOymol/L上游引物和IOymol/L下游引物各 0. 6yL，MLV/RNasin/HS-Taq酶混合液0. 8yL，RNA模板2yL，其余由雙蒸水補(bǔ)足至20yL; 反應(yīng)條件為：50°C反轉(zhuǎn)錄 30min，94°C預(yù)變性 3min，然后 94°C30s、55°C30s、72°C80s，共 30 次循環(huán)后，72°C最后延伸7min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種GII.17型諾如病毒基因組擴(kuò)增引物和擴(kuò)增方法。本發(fā)明分別以七對(duì)引物作為擴(kuò)增引物的上下游引物，以GII.17型諾如病毒的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)序，然后再拼接比對(duì)，得到GII.17型諾如病毒基因組全長(zhǎng)序列。本發(fā)明針對(duì)新出現(xiàn)的GII.17型諾如病毒流行基因型，根據(jù)基因組所包含的三個(gè)開放閱讀框設(shè)計(jì)了“4+1+1”的分段擴(kuò)增策略，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物，將該擴(kuò)增引物應(yīng)用于實(shí)際檢出樣本，獲得了GII.17型諾如病毒基因組序列。本發(fā)明方法具有操作簡(jiǎn)單、周期短、成本低以及靈敏度高的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、檢驗(yàn)檢疫等具有諾如病毒檢測(cè)需求及相應(yīng)的科研領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/10
【公開號(hào)】CN105176984
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】薛亮, 吳清平, 蔡偉程, 蔡淑珍, 張菊梅
【申請(qǐng)人】廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年9月23日